Содержание

Ограничители перенапряжения нелинейные (ОПН)

  1. Назначение и принцип действия ОПН
  2. Обозначение ОПН на схемах. Принципиальные схемы подключения
  3. ОПН типа КР, РТ, РВ, РК
  4. Конструкция ОПН
  5. Выбор ОПН
  6. Технические характеристики ОПН
  7. Внешний вид и размеры ОПН 6-750 кВ
  8. ГОСТы ОПН

1. Назначение и принцип действия ОПН

Ограничители перенапряжения нелинейные (ОПН) – это широко распространенные в промышленности высоковольтные аппараты, применяемые в сетях среднего и высокого классов напряжения переменного тока. Нелинейные ограничители защищают изоляцию электрооборудования подстанции и электрических сетей от скачков коммутационных и атмосферных перенапряжений.

Ограничители предназначены для эксплуатации при температуре от – 60°С до + 45°С (для внутренней установки максимальная температура + 55°С) и до 1000 метров над уровнем моря.

Защитная функция ОПН состоит в том, что при номинальной работе электроустановки ток, ограничитель перенапряжения пропускает ничтожно малый – доли миллиампера.

Если происходит импульсный скачек напряжения, сопротивление ограничителя мгновенно падает до единиц Ом, варисторы при этом переходят в проводящее состояние и ограничивают дальнейшее нарастание перенапряжения, преобразовывая энергию импульса в тепловую энергию, которая рассеивается в окружающую среду. Ограничитель возвращается вновь в непроводящее состояние после окончания волны перенапряжения. ОПН может эффективно ограничивать высокочастотные скачки перенапряжения за счет мгновенного перехода в проводящее состояние.

 

Рисунок 1 – График изменения напряжения на оборудовании и тока через ОПН при воздействии перенапряжений.

2. Обозначение ОПН на схемах. Принципиальные схемы подключения

Стандартное графическое обозначение элемента схемы ОПН приведено на рисунке 2.


Рисунок 2 – Графическое обозначение ОПН


Рисунок 3 – Схема подключения ОПН для защиты промышленных и жилых потребителей.


Рисунок 4 – Защита РУ 10 кВ от набегающих грозовых волн с ВЛ напряжением 10 кВ на деревянных опорах.

3. ОПН типа КР, РТ, РВ, РК

ОПН–КР предназначены для защиты электрооборудования в сетях от 6 до 10 кВ. Рекомендуются для защиты трансформаторов и двигателей.

ОПН-РТ рекомендованы для защиты ответственного электрооборудования в сетях от 3 до 10 кВ при частых воздействиях перенапряжений. Используются для защиты трансформаторов электродуговых печей, электрических генераторов и др.

ОПН-РВ рекомендуются для применения вместо вентильных разрядников серии РВО. Ограничители типа ОПН-РВ не требуют проведения предварительных расчетов, так как отстроены от перенапряжений при однофазных дуговых замыканиях.

ОПН-РК предназначены для эксплуатации в районах 1-3 степени загрязнения атмосферы, применяются в сетях 35-110 кВ. Разработаны специально для защиты изоляции нейтрали трансформаторов 110 кВ.

4. Конструкция ОПН

Ограничители типов КР, РТ и РВ представляют собой высоковольтные аппараты, состоящие из последовательно соединенных варисторов, размещенных внутри изоляционного корпуса. Безопасное нахождение ОПН под напряжением обеспечивает высоко-нелинейная вольтамперная характеристика варисторов. При изготовлении ограничителей классов напряжения 3-10кВ, колонка резисторов находится между металлическими электродами и запрессовывается в оболочку из особого атмосфероустойчивого полимера.

Ограничители типа РК состоят из блоков варисторов соединенных последовательно, находящихся внутри покрышки. Покрышка состоит из стеклопластикового цилиндра.

5. Выбор ОПН

При выборе ОПН для конкретного случая, необходимо применять официальные рекомендации международных стандартов или методические указания (МЭК 60099-5).
Параметры ограничителя выбирают исходя из назначения, места установки, необходимого уровня ограничения перенапряжений, схемы сети и ее параметров (способа заземления нейтрали, максимального рабочего напряжения сети, степени компенсации емкостного тока на землю и его величины и т.д.).

По назначению ограничители применяют для защиты оборудования от грозовых и коммутационных перенапряжений. Места для установки, а так же расстояния от защищаемого оборудования до ограничителей должны соответствовать требованиям «Правил устройства электроустановок», раздел 4 седьмое издание ПУЭ.

6. Технические характеристики ОПН

Таблица 1 – Технические характеристики ограничителей типа ОПН 6 – 10кВ (ОПН-КР/TEL–X/X УХЛ1(2)10/11.5)

Наименование параметров 6/6.06/6.910/10.510/11.510/12
Класс напряжения сети, кВ  6 6  10 10 10
 Наибольшее длительно допустимое рабочее напряжение Uнд; кВ  6.0 6.9 10.5 11.5 12.0
 Номинальный разрядный ток 8/20 мкс, Iн; кА 10 10 10 10 10
 Остаточное напряжение Uост; кВ; не более:          
– при коммутационном импульсе тока          
 125 А 30/60мкс  14.
3
16.2 24.8 26.9 29.7
 250 А 30/60мкс  14.6  16.5  25.4  27.6  30.4
 500 А 30/60мкс  15.0  17.5  26.1  28.3  31.3
– при грозовом импульсе тока          
5000 А, 8/20мкс 17.7 20.0 30.7 33.3 36.9
10000 А, 8/20мкс 19.0 21.5 33.0 35.8 39.6
20000 А, 8/20мкс 21.2 24.0 36.7 39.9 44.1
при крутом импульсе тока 10000А, 1/10мкс 21.3 24.1 36.
9
40.1 44.3
Емкостный ток проводимости Iс, мА, не более:          
амплитуда 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
действующее значение 0.45 0.45 0.45 0.45 0.45
Удельная энергия ОПН, кДж/кВ Uнд, не менее 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6
Максимальная амплитуда импульса тока 4/10мкс, кА 100 100 100 100 100
Взрывобезопасный ток при коротком замыкании Iкз, кА 16 16 16 16 16
Максимальное изгибающее усилие, Н 305 305 305 305 305

Характеристики ОПН представленные на рисунках 5 и 6 получены для ограничителей производителя TEL.


Характеристика «напряжение-время» ограничителей 6 - 10кВ типа ОПН–КР при образовании квазистационарных перенапряжений показана на рисунке – 5.


Рисунок 5 – Характеристика «напряжение–время»: 1 – с предварительным нагружением 3.6 кДж/кВ Uнд; 2 — без предварительного нагружения энергией.

Таблица 2 – Технические характеристики ограничителей типа ОПН 35 – 110 – 220 кВ (ОПН/TEL–X/X–550 УХЛ1)

Наименование параметров 35/40.5110/78110/84220/146220/156220/168
Класс напряжения сети, кВ 35 110 110 220 220 220
 Наибольшее длительно допустимое рабочее напряжение Uнд; кВ 40.5 78 84 146 156 168
 Номинальный разрядный ток 8/20 мкс, Iн; кА 10 10 10 10 10 10
 Остаточное напряжение Uост; кВ; не более:
           
– при коммутационном импульсе тока            
 125 А 30/60мкс 93 178 191 334 356 386
 250 А 30/60мкс 98 188 202 352 376 404
 500 А 30/60мкс 101 192 207 362 384 414
– при грозовом импульсе тока            
5000 А, 8/20мкс 119 230 247 428 460 494
10000 А, 8/20мкс 130 250 269 468 500 538
20000 А, 8/20мкс 146 295 301 524 560 602
при крутом импульсе тока 10000А, 1/10мкс 153 295 317 552 590 634
Емкостный ток проводимости Iс, мА, не более:            
амплитуда 0. 9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9
действующее значение 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
Удельная энергия ОПН, кДж/кВ Uнд, не менее 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5
Максимальная амплитуда импульса тока 4/10мкс, кА 100 100 100 100 100
100
Взрывобезопасный ток при коротком замыкании Iкз, кА 30 30 30 30 30 30
Максимальное изгибающее усилие, Н 580 600 600 640 640 640

Характеристика «напряжение–время» ограничителей 35 – 220кВ типа ОПН–35,110,220 при образовании квазистационарных перенапряжений показана на рисунке – 6 .


Рисунок 6 – Характеристика «напряжение–время»: 1 — с предварительным рассеиванием энергии 5.5 кДж/кВ Uнд; 2 — без предварительного рассеивания энергии

7. Внешний вид и размеры ОПН 6-750кВ

Ограничители подвесного исполнения на классы напряжения 6-35кВ приведены на рисунке 7.



Рисунок 7 – ОПН подвесного исполнения: а) ОПН 6кВ; б) ОПН 10кВ; в) ОПН 35кВ


Внешний вид и размеры ОПН 110-220кВ подвесного исполнения представлены на рисунке 8.


Рисунок 8 – ОПН подвесного исполнения: а) ОПН 110кВ; б) ОПН 220кВ

Внешний вид и размеры ОПН 330-750кВ представлены на рисунках 9 и 10.


Рисунок 9 – а) ОПН 330кВ; б) ОПН 500кВ

Рисунок 10 – ОПН 750кВ

8. ГОСТы ОПН

1. ГОСТ Р 52725-2007. Ограничители перенапряжений нелинейные для электроустановок переменного тока напряжением от 3 до 750 кВ. Общие технические условия.

2. ГОСТ Р 53735.5-2009 Разрядники вентильные и ограничители перенапряжений нелинейные для электроустановок переменного тока на напряжение от 3 до 750 кВ. Часть 5. Рекомендации по выбору и применению.

3. ГОСТ 34204-2017 Ограничители перенапряжений нелинейные для тяговой сети железных дорог. Общие технические условия.

4. Правила устройства электроустановок.

Обозначение опн на однолинейной схеме – Telegraph

Обозначение опн на однолинейной схеме

ГОСТ Р 55167-2012 Ограничители перенапряжений нелинейные для тяговой сети железных дорог. Общие технические условия

=== Скачать файл ===

Условные графические обозначения на электрических схемах

Изображений элементов электрических схем

Электростанции ЭС и подстанции ПС — обозначения без конкретизации конструктивного исполнения при необходимости различения действующих и проектируемых объектов в первом случае применяется штриховка , ГОСТ 2. ПС с указанием вида установки, ГОСТ 2. Машины электрические, ГОСТ 2. Трансформаторы и автотрансформаторы, ГОСТ 2. Катушки индуктивности, трансформаторы тока, ГОСТ 2. Коммутационные устройства высокого напряжения, ГОСТ 2. Некоторые однолинейные обозначения аппаратов высокого напряжения, не предусмотренные стандартами ЕСКД, но принятые практикой: Провода, кабели и шины, ГОСТ 2. Заземления, соединения, повреждения проводов, кабелей и шин, ГОСТ 2. Обозначения общего применения, ГОСТ 2. Приводы коммутационных аппаратов, ГОСТ 2. Источники тока, ГОСТ 2. Электроизмерительные приборы, ГОСТ г. Обмотки электромеханических устройств пускатели, электромагниты, реле , ГОСТ 2. Контакты коммутационных устройств, общие обозначения, ГОСТ 2. Контакты коммутационных устройств замыкающие, ГОСТ 2. Контакты коммутационных устройств импульсные размыкающие, ГОСТ 2. Примеры обозначений коммутационных устройств в сборе, ГОСТ 2. Выключатели кнопочные с самовозвратом, ГОСТ 2. Выключатели кнопочные без самовозврата, ГОСТ 2. Контактные соединения, ГОСТ 2. Резисторы постоянные и терморезисторы, ГОСТ 2. Резисторы переменные, ГОСТ 2. Полупроводниковые приборы, ГОСТ 2. Транзисторы, приборы излучающие и фоточувствительные, ГОСТ 2. Выпрямительные схемы, ГОСТ 2. Приборы электровакуумные, ГОСТ 2. Линии электроснабжения и связи, виды прокладки, СТ СЭВ — Линии электроснабжения и связи, опоры ВЛ, СТ СЭВ Линии электроснабжения и связи, элементы и конструкции ВЛ, СТ СЭВ — Линии электроснабжения и связи, элементы и защита подземных, подводных линий, Стандарт СЭВ — В таблице приведены обозначения лишь наиболее употребительных видов оборудования и, как правило, только основные варианты обозначения. Допускается выполнять графические обозначения в зеркальном изображении. Бланки ПС Сбыт ОТ. Стартовая Статьи Документация Подстанции Распределительные сети Охрана труда Воздушные линии Энергонадзор Гражданская оборона Разное Книги Законы Правила Оборудование РЗиА Учеба Разное Оборудование Справка Подстанции Трансформаторы Практика Теория Статьи Справка Выключатели Разъединители ТТ и ТН Кабели Силовые кабели Провода и шнуры Кабельная арматура ВЛ Низковольтное РЗАиА Эл. Условные графические обозначения на электрических схемах. Подстанции Трансформаторы Выключатели Разъединители ТТ и ТН Низковольтное Остальное Документация.

Истерический приступ причины клиника лечение

Далдан перевод с азербайджанского на русский

Каталог деталей 2110

Как разобрать ноутбук hp 4720s

Особенности международного частного права

Brandroom барнаул каталог

Списки дорам 2014

Площадь дом 1

Каждый человек имеет право на слово

Государства монархии европы

Host name перевод

Полочка для цветов своими руками из дерева

Как проверить результат спермограммы

Сколько стоит новая машина 15

Донат вода инструкция отзывы

Видео флешмоб делайте делайте зарядку

Сколько квт для нагрева куба воды

Толкователь натальной карты 8 букв

Сколькими способами можно выбрать культоргаи казначея

Описание памятников иркутска

Как работают ограничители перенапряжения

  1. Главная
  2. org/ListItem"> Электрические аппараты
  3. ОПН

Расшифруем понятие ОПН в энергетике (электрике) - ограничитель напряжения нелинейный. Это электрический аппарат, предназначенный для защиты от грозовых и коммутационных перенапряжений изоляции электроустановок в сетях низкого и высокого напряжения.

Буква Н в аббревиатуре ОПН означает нелинейный, а не напряжение.

Устройство опн

Нелинейным в устройстве ОПНа является сопротивление - переменное сопротивление (варистор).

Его переменность важна при изменении токов и видна на вольтамперной характеристике о-пэ-эн-а.

Сопротивления выпускаются в виде дисков, которые состоят из металлооксидной керамики. Они соединяются последовательно и параллельно внутри изоляционного корпуса, в зависимости от класса напряжения и пропускной способности ОПН.

Для каждого ОПН важно, чтобы все сопротивления имели одинаковые вольтамперные характеристики. В обратном случае, отдельные сопротивления будут нагреваться сильнее, что будет приводить к разрушениям самих сопротивлений и всего ОПН в целом.

Нелинейные сопротивления располагаются внутри корпуса из изоляции. Раньше для изоляции использовали фарфор, керамику. В настоящее время можно встретить ОПН, внешняя изоляции которых выполнена из полимерного изоляционного материала.

Наружная изоляция выполнена сложной формы, количество и форма ребер определяется требованием пути утечки внешней изоляции. Сама характеристика пути утечки определяет минимальный размеры ОПН.

Важной характеристикой состояния изоляции является чистота ОПНа, поэтому важно очищать его от пыли, грязи, так как эти факторы портят прочность внешней изоляции.

Внутренняя изоляции более мощная и прочная, чем внешняя.

Кроме сопротивлений и изоляции, в состав аппарата входят выводы подключения. Ограничитель подключается между фазой и землей.

опн обозначение на схеме

Ниже рассмотрим как выглядит ОПН на однолинейной схеме. Переменный резистор, который обозначается FV, как и разрядник.

Как работает опн

Принцип действия ОПН в снижении перенапряжения, за счет поглощения варисторами броска тока, выделяемого при уменьшении их сопротивления при возникновении перенапряжения. Путано написал, но думаю сейчас более подробно разберемся и станет доступнее.

Для понимания принципа работы ОПН рассмотрим обобщенную вольт-амперную характеристику переменного резистора.

Условно её можно разделить на три зоны по оси икс - зона малых токов, зона средних токов и зона высоких токов. По оси игрик также можно разбить на зону рабочего напряжения, зону низкого напряжения и зону перенапряжений.

На каждом из этих участков сопротивление ведет себя по-разному. В первой зоне ОПН находится в рабочем состоянии, сопротивление резисторов велико и по ОПНу течет малый ток.

При возникновении перенапряжения варистор переходит на участок 2 своей ВАХ. Перенапряжение создает импульс тока на ОПН, резисторы переходят в проводящее состояние, поглощают импульс тока и рассеивают его тепловой энергией.

За счет отведенного импульса тока перенапряжение уменьшается и резистор возвращается в зону 1. Аналогично и в зоне 3, но там перегиб кривой еще больше и бросок тока становится еще сильнее.

графические и буквенные по ГОСТ

Как невозможно читать книгу без знания букв, так невозможно понять ни один электрический чертеж без знания условных обозначений.

В этой статье рассмотрим условные обозначения в электрических схемах: какие бываю, где найти расшифровку, если в проекте она не указана, как правильно должен быть обозначен и подписан тот или иной элемент на схеме.

Введение


Но начнем немного издалека...
Каждый молодой специалист, который приходит в проектирование, начинает либо со складывания чертежей, либо с чтения нормативной документации, либо нарисуй «вот это» по такому примеру. Вообще, нормативная литература изучается по ходу работы, проектирования.

Невозможно прочитать всю нормативную литературу, относящуюся к твоей специальности или, даже, более узкой специализации. Тем более, что ГОСТ, СНиП и другие нормативы периодически обновляются. И каждому проектировщику приходится отслеживать изменения и новые требования нормативных документов, изменения в линейках производителей электрооборудования, постоянно поддерживать свою квалификацию на должном уровне.

Помните, как Льюиса Кэролла в «Алисе в Стране Чудес»?

«Нужно бежать со всех ног, чтобы только оставаться на месте, а чтобы куда-то попасть, надо бежать как минимум вдвое быстрее!»

Это я не к тому, чтобы поплакаться «как тяжела жизнь проектировщика» или похвастаться «смотрите, какая у нас интересная работа». Речь сейчас не об этом. Учитывая такие обстоятельства, проектировщики перенимают практический опыт от более опытных коллег, многие вещи просто знают как делать правильно, но не знают почему. Работают по принципу «Здесь так заведено».

Порой, это достаточно элементарные вещи. Знаешь, как сделать правильно, но, если спросят «Почему так?», ответить сразу не сможешь, сославшись хотя бы на название нормативного документа.

В этой статье я решил структурировать информацию, касающуюся условных обозначений, разложить всё по полочкам, собрать всё в одном месте.

Виды и типы электрических схем

Прежде, чем говорить об условных обозначения на схемах, нужно разобраться, какие виды и типы схем бывают. С 01.07.2009 на территории РФ введен в действие ГОСТ 2.701-2008 «ЕСКД. Схемы. Виды и типы. Общие требования к выполнению».
В соответствии с этим ГОСТ, схемы разделяются на 10 видов:

  1. Схема электрическая
  2. Схема гидравлическая
  3. Схема пневматическая
  4. Схема газовая
  5. Схема кинематическая
  6. Схема вакуумная
  7. Схема оптическая
  8. Схема энергетическая
  9. Схема деления
  10. Схема комбинированная

Виды схем подразделяются на восемь типов:

  1. Схема структурная
  2. Схема функциональная
  3. Схема принципиальная (полная)
  4. Схема соединений (монтажная)
  5. Схема подключения
  6. Схема общая
  7. Схема расположения
  8. Схема объединенная

Меня, как электрика, интересуют схемы вида «Схема электрическая». Вообще, описание и требования к схемам приведены в ГОСТ 2.701-2008 на примере электрических схем, но с 01 января 2012 действует ГОСТ 2.702-2011 «ЕСКД. Правила выполнения электрических схем». Большей частью текст этого ГОСТ дублирует текст ГОСТ 2.701-2008, ссылается на него и другие ГОСТ.

ГОСТ 2.702-2011 подробно описывает требования к каждому виду электрической схемы. При выполнении электрических схем следует руководствоваться именно этим ГОСТ.

ГОСТ 2.702-2011 дает следующее определение понятия электрической схемы: «Схема электрическая — документ, содержащий в виде условных изображений или обозначений составные части изделия, действующие при помощи электрической энергии, и их взаимосвязи». Далее ГОСТ ссылается на документы, регламентирующие правила выполнения условных графических изображения, буквенных обозначений и обозначений проводов и контактных соединений электрических элементов. Рассмотрим каждый отдельно.

Графические обозначения в электрических схемах

В части графических обозначений в электрических схемах ГОСТ 2. 702-2011 ссылается на три других ГОСТ:

  • ГОСТ 2.709-89 «ЕСКД. Обозначения условные проводов и контактных соединений электрических элементов, оборудования и участков цепей в электрических схемах».
  • ГОСТ 2.721-74 «ЕСКД. Обозначения условные графические в схемах. Обозначения общего применения»
  • ГОСТ 2.755-87 «ЕСКД. Обозначения условные графические в электрических схемах. Устройства коммутационные и контактные соединения».

Условные графические обозначения (УГО) автоматов, рубильников, контакторов, тепловых реле и прочего коммутационного оборудования, которое используется в однолинейных схемах электрических щитов, определены в ГОСТ 2.755-87.

Однако, обозначение УЗО и дифавтоматов в ГОСТ отсутствует. Думаю, в скором времени он будет перевыпущен и обозначение УЗО будет добавлено. А пока, каждый проектировщик изображает УЗО по собственному вкусу, тем более, что ГОСТ 2.702-2011 это предусматривает. Достаточно привести обозначение УГО и его расшифровку в пояснениях к схеме.

Дополнительно к ГОСТ 2.755-87 для полноты схемы понадобится использование изображений из ГОСТ 2.721-74 (в основном для вторичных цепей).

Все обозначения коммутационных аппаратов построены на четырех базовых изображениях:

с использованием девяти функциональных признаков:

Основные условные графические обозначения, используемые в однолинейных схемах электрических щитов:

НаименованиеИзображение
Автоматический выключатель (автомат)
Выключатель нагрузки (рубильник)
Контакт контактора
Тепловое реле
УЗО
Дифференциальный автомат
Предохранитель
Автоматический выключатель для защиты двигателя (автомат со встроенным тепловым реле)
Выключатель нагрузки с предохранителем (рубильник с предохранителем)
Трансформатор тока
Трансформатор напряжения
Счетчик электрической энергии
Частотный преобразователь
Замыкающий контакт нажимного кнопочного выключателя без самовозврата с размыканием и возвратом элемента управления автоматически
Замыкающий контакт нажимного кнопочного выключателя без самовозврата с размыканием и возвратом элемента управления посредством вторичного нажатия кнопки
Замыкающий контакт нажимного кнопочного выключателя без самовозврата с размыканием и возвратом элемента управления посредством вытягивания кнопки
Замыкающий контакт нажимного кнопочного выключателя без самовозврата с размыканием и возвратом элемента управления посредством отдельного привода (например, нажатия кнопки-сброс)
Контакт замыкающий с замедлением, действующим при срабатывании
Контакт замыкающий с замедлением, действующим при возврате
Контакт замыкающий с замедлением, действующим при срабатывании и возврате
Контакт размыкающий с замедлением, действующим при срабатывании 
 Контакт размыкающий с замедлением, действующим при возврате 
 Контакт замыкающий с замедлением, действующим при срабатывании и возврате
Катушка контактора, общее обозначение катушки реле
Катушка импульсного реле
Катушка фотореле
Катушка реле времени
Мотор-привод
Лампа осветительная, световая индикация (лампочка)
Нагревательный элемент
Разъемное соединение (розетка):
гнездо
штырь
Разрядник
Ограничитель перенапряжения (ОПН), варистор
Разборное соединение (клемма)
Амперметр
Вольтметр
Ваттметр
Частотометр

Обозначения проводов, шин в электрических щитах определяется ГОСТ 2. 721-74.

Буквенные обозначения в электрических схемах

Буквенные обозначения определены ГОСТ 2.710-81 «ЕСКД. Обозначения буквенно-цифровые в электрических схемах».

Обозначения дифавтоматов и УЗО в этом ГОСТ отсутствует. На различных сайтах и форумах в интернете долго обсуждали как же правильно обозначать УЗО и дифавтомат. ГОСТ 2.710-81 в п.2.2.12. допускает использование многобуквенных кодов (а не только одно- и двухбуквенных), поэтому до введения нормативного обозначения я для себя принял трехбуквенное обозначение УЗО и дифавтомата. К двухбуквенному обозначению рубильника я добавил букву D и получил обозначение УЗО. Аналогично поступил с дифавтоматом.

Думаю, в скором времени он будет перевыпущен и обозначение УЗО будет добавлено.

Обозначения основных элементов, используемых в однолинейных схемах электрических щитов:

НаименованиеОбозначение
Автоматический выключатель в силовых цепяхQF
Автоматический выключатель в цепях управленияSF
Автоматический выключатель с дифференциальной защитой (дифавтомат)QFD
Выключатель нагрузки (рубильник)QS
Устройство защитного отключения (УЗО)QSD
КонтакторKM
Тепловое релеF, KK
Реле времениKT
Реле напряженияKV
ФоторелеKL
Импульсное релеKI
Разрядник, ОПНFV
Плавкий предохранительFU
Трансформатор токаTA
Трансформатор напряженияTV
Частотный преобразовательUZ
АмперметрPA
ВольтметрPV
ВаттметрPW
ЧастотометрPF
Счетчик активной энергииPI
Счетчик реактивной энергииPK
ФотоэлементBL
Нагревательный элементEK
Лампа осветительнаяEL
Прибор световой индикации (лампочка)HL
Штепсельный разъем (розетка)XS
Выключатель или переключатель в цепях управленияSA
Выключатель кнопочный в цепях управленияSB
КлеммыXT

Изображение электрооборудования на планах

Хотя ГОСТ 2. 701-2008 и ГОСТ 2.702-2011 предусматривают вид электрической схемы «схема расположения», при проектировании зданий и сооружений следует руководствоваться ГОСТ 21.210-2014 «СПДС. Изображения условные графические электрооборудования и проводок на планах». Данный ГОСТ устанавливает условные обозначения электропроводок, прокладок шин, шинопроводов, кабельных линий, электрического оборудования (трансформаторов, электрических щитов, розеток, выключателей, светильников) на планах прокладки электрических сетей.

Эти условные обозначения применяются при выполнении чертежей электроснабжения, силового электрооборудования, электрического освещения и других чертежей. Также данные обозначения используются для изображении потребителей в однолинейных принципиальных схемах электрических щитов.

Условные графические изображения электрооборудования, электротехнических устройств и электроприемников

Условные графические обозначения линий проводок и токопроводов

К сожалению, AutoCAD в базовой поставке не содержит все необходимые типы линий.

Проектировщики решают эту проблему по-разному:

  • большинство выполняет отрисовку проводки обычной линией, а потом дополняет обозначениями кружков, квадратиков и пр.;
  • продвинутые пользователи AutoCAD создают собственные типы линий.

Я — сторонник второго способа, т.к. он гораздо удобнее. Если вы используете специальный тип линии, то при её перемещении все «дополнительные» обозначения также перемещаются, ведь они часть линии.

Создать собственный тип линии в AutoCAD достаточно просто. Вы потратите некоторое время на освоение этого навыка, зато сэкономите потом массу времени при проектировании.

Изображение вертикальной прокладки удобнее всего сделать при помощи блоков AutoCAD, а лучше при помощи динамических блоков.

Условные графические изображения шин и шинопроводов

Отрисовку шин и шинопроводов в AutoCAD удобно выполнять при помощи полилинии и/или динамических блоков.

Условные графические изображения коробок, шкафов, щитов и пультов

НаименованиеИзображение
Коробка ответвительная
Коробка вводная
Коробка протяжная, ящик протяжной
Коробка, ящик с зажимами
Шкаф распределительный
Щиток групповой рабочего освещения
Щиток групповой аварийного освещения
Щиток лабораторный
Ящик с аппаратурой
Ящик управления
Шкаф, панель, пульт, щиток одностороннего обслуживания, пост местного управления
Шкаф, панель двухстороннего обслуживания
Шкаф, щит, пульт из нескольких панелей одностороннего обслуживания
Шкаф, щит, пульт из нескольких панелей двухстороннего обслуживания
Щит открытый
Ящик трансформаторный понижающий (ЯТП)

Отрисовку в AutoCAD удобно выполнять при помощи блоков и динамических блоков.

Условные графические обозначения выключателей, переключателей

ГОСТ 21.210-2014 не предусматривает условных изображения для светорегуляторов (диммеров) и отдельного изображения для кнопочных выключателей, поэтому я ввёл для них собственные обозначения в соответствии с п.4.7.

Отрисовку в AutoCAD удобно выполнять при помощи динамических блоков. Я себе сделал один динамический блок для всех типов выключателей.

Условные графические обозначения штепсельных розеток

Отрисовку в AutoCAD удобно выполнять при помощи динамических блоков. Я себе сделал один динамический блок для всех типов розеток.

Условные графические обозначения светильников и прожекторов

Радует, что в обновленной версии ГОСТ добавлены изображения светодиодных светильников и светильников с компактными люминесцентными лампами.

Отрисовку светильников в AutoCAD удобно выполнять при помощи динамических блоков.

Условные графические обозначения аппаратов контроля и управления

Отрисовку в AutoCAD удобно выполнять при помощи динамических блоков.


Подпишитесь и получайте уведомления о новых статьях на e-mail

Читайте также:

Нормальные схемы электрических соединений объектов электроэнергетики

 Правила выполнения нормальных схем электрических соединений объектов электроэнергетики, определены двумя стандартами. Это Стандарт Организации ОАО «ФСК ЕЭС» СТО 56947007-25.040.70.101-2011 Раздел 2 и ГОСТ Р 56303-2014.

 Несмотря на то, что на данный момент оба стандарта действующие и определяют требования к выполнению одних и тех же типов схем, требования в них, несколько отличаются (вероятно разработчики стандартов не дружат ...).

 В данном материале, при составлении примеров графических обозначений элементов схем электрических соединений объектов электроэнергетики, за основу взят ГОСТ Р 56303-2014, так как по дате введения в действие он новее.
 Если вид графических обозначений, приведенных в примерах стандарта СТО 56947007-25. 040.70.101-2011, отличается от аналогичных, приведенных в ГОСТ Р 56303-2014, добавлены соответствующие примечания.

 

Цветовое исполнение классов напряжения.
Класс напряженияГОСТ Р 56303-2014СТО 56947007-25.040.70.101-2011
Наименование цветаСпектр (RGB)Наименование цветаСпектр (RGB)
1150 кВсиреневый205:138:255сиреневый205:138:255
800 кВтемно синий0:0:168темно синий0:0:200
750 кВтемно синий0:0:168темно синий0:0:200
500 кВкрасный213:0:0красный165:15:10
400 кВоранжевый255:100:30оранжевый240:150:30
330 кВзеленый0:170:0зеленый0:140:0
220 кВжелто-зеленый181:181:0желто-зеленый200:200:0
150 кВхаки170:150:0хаки170:150:0
110 кВголубой0:153:255голубой0:180:200
60 кВлиловый255:51:204--
35 кВкоричневый102:51:0коричневый130:100:50
20 кВярко-фиолетовый160:32:240коричневый130:100:50
15 кВярко-фиолетовый160:32:240--
10 кВфиолетовый102:0:204фиолетовый100:0:100
6 кВтемно-зеленый0:102:0светло-коричневый200:150:100
3 кВтемно-зеленый0:102:0--
ниже 3 кВсерый127:127:127--
до 1 кВ--серый190:190:190

Условные графические обозначения элементов нормальных схем электрических соединений объектов электроэнергетики.

В примерах, использованы условные графические обозначения из библиотеки трафаретов Visio Нормальная схема ПС.

Шаг модульной сетки 2,5 мм.

Толщина линий условных обозначений и линий электрической связи 0,4 мм (По стандарту от 0,2 до 1,0 мм. Рекомендуемая - от 0,3 до 0,4 мм.)

Графическое обозначение трансформаторов.

 

Графическое обозначение коммутационных аппаратов.

 

 Графическое обозначение устройств компенсации, фильтров.

 

Графическое обозначение разрядников, ОПН.

 

Графическое обозначение генераторов, электродвигателей.

 

Графическое обозначение предохранителей.

 

Графическое обозначение линий электрической связи, шин, заземления.
 НаименованиеОбозначение
 1. Линия электрической связи, ошиновка.
 2.

 ЛЭП - линия электропередач.

 Отображается утолщенными линиями (двухкратное или большее увеличение толщины по отношинию к линиям, которыми выполнены УГО и ошиновка).

 3.

  Кабельная линия.

 Линию электрической связи с одним ответвлением допускается изображать без точки.

 

 
 4. Пересечение линий электрической связи. 
 5.

 Ответвления линии электрической связи.

 Точка соединения, должна выполняться цветом, соответствующим классу напряжения линий электрической связи.

 Линию электрической связи с одним ответвлением допускается изображать без точки.

 
 6.

 Шина.

 Выполняться цветом, соответствующим классу напряжения, а точки подключения отводов, белым.

 
 7. Заземление. 
Примечания:
 1. Для линий электропередач (п. 2,3), в СТО 56947007-25.040.70.101-2011, особых указаний не найдено. Вероятно, их толщина, по этому стандарту, равна толщине линий электрической связи.

 

 Пример изображения нормальной схемы электрических соединений условной подстанции, выполненной по ГОСТ Р 56303-2014 (формат PDF).

Схема выполнена в программе Visio с использование библиотеки трафаретов:

Как начертить нормальную схему электрических соединений объекта электроэнергетики (электрической подстанции, распределительного устройства)

 


Обозначение УЗИП на схемах – RozetkaOnline.COM

Устройства защиты от импульсных перенапряжений, сокращенно УЗИП, оберегают электрооборудование от грозовых и коммутационных импульсных токов, например, при удаленном ударе молнии.

Они применяются не только в промышленности, часто используются и в бытовых схемах электроснабжения, при строительстве частных домов.

Графическое обозначение УЗИП

Общий вид УЗИП для схем, регламентируется в ГОСТ Р МЭК 61643-12-2011 (Читать PDF) «Устройства защиты от импульсных перенапряжений в низковольтных силовых распределительных системах. Принципы выбора и применения», согласно которому, условное обозначение выглядит следующим образом (см. изображение ниже):

Современные модульные ограничители импульсных перенапряжений, устанавливаемые в электрических щитах (ВРУ, ЩС и т.д.), в зависимости от типа, включают и другие дополнительные средства защиты.

Например, в одном корпусе содержат как ограничивающие напряжение, так и ток компоненты. В таких случаях, допустимо к стандартному схематическому обозначению, добавлять и маркировку соответствующих контролируемых величин, например, так:

Также нередко на схемах, где применяется УЗИП, показывается графическое обозначение основного элемента, на котором он построен – Варистора, Разрядника или Газонаполненного разрядника:

Каждый из представленных видов защиты имеет свои плюсы и минусы, поэтому, информация из однолинейной схемы о том, какое оборудование установлено, бывает очень важна. Дополнительно, об этом сообщает и маркировка УЗИП на схемах буквенным кодом.

Буквенная маркировка

Для устройств защиты от импульсных перенапряжений отдельного буквенного кода нет. Поэтому, на однолинейных схемах, принято маркировать УЗИП согласно ГОСТ 2-710-81 (ЧИТАТЬ PDF) “Обозначения буквенно-цифровые в электрических схемах” двумя возможными кодами, в зависимости от основного компонента, используемого в конкретной модели УЗИП:

FV – на разрядниках

RU – на варисторах

На изображении ниже, пример правильного обозначения узип на однолинейной схеме простейшего электрического щита:

На схеме показано устройство в которое, после вводного двухполюсного автомата, подключен нулевой и фазный проводники, а третяя клемма – соединена с шиной защитного заземления электрощита PE.

обозначение трехфазного узип на схеме

Для трехфазных УЗИП допустимо использовать стандартное, представленное выше обозначение , дополнительно показывая количество подключаемых проводников.

Но встречаются схемы, на которых трехфазные УЗИП, показаны в виде трех отдельных элементов, например варисторов, объединенных в одном корпусе. Оба этих вида правильные, но для удобства, простоты и лучшей читаемости чертежа, лучше пользоваться первым вариантом.

назначение, принцип работы и конструкция

Возникновение аварийных ситуаций при эксплуатации электрических сетей и оборудования в большинстве ситуаций вызываются импульсными скачками напряжения в результате замыкания линий, воздействия атмосферного электричества, ошибок при коммутационных переключениях. Для исключения подобного применяются ОПН.

Аббревиатура ОПН расшифровывается как ограничитель перенапряжения. Данные устройства предназначены для защиты линий и оборудования в ситуациях, когда по той или иной причине нагрузка возрастает в разы, с опасностью возникновения аварии. Рассмотрим особенности конструктивного устройства данных элементов, применяемые разновидности и их технические характеристики, прочие сопутствующие моменты.

ОПН

Конструкция

ОПН представляет собой полупроводниковый элемент, отличающийся нелинейным значением сопротивления. Он выполнен в виде вилитовых дисков, в качестве материала которого используется оксид цинка с добавлением различных примесей.

Указанные диски снабжены защитным покрытием, с электрическими выводами на концах. На один из контактов подаётся напряжение, второй выводится на землю.

ОПН состоит из следующих конструктивных элементов:

  • электрода,
  • полиамидного корпуса,
  • термоусадочной трубки,
  • варистора,
  • силиконовой оболочки.
Конструкция ОПН до 1000 ВКонструкция ОПН выше 1000 В

Принцип действия

В основу принципа действия данного элемента заложена нелинейная характеристика сопротивления. При штатных характеристиках напряжения, его величина близка к нулю, поэтому цепь не замыкается через указанный прибор.

При резком возрастании напряжения, одновременно увеличивается сопротивление. В результате ток проходит через ОПН, замыкаясь на землю. Таким способом обеспечивается выполнение защитной функции.

Виды

В связи с большим разнообразием выполняемых функций, ОНП классифицируют по следующим показателям:

Структура условного обозначение ОПН

Может использоваться комбинация нескольких устройств, с выполнением ступенчатой защиты.

Обозначение ОПН и разрядников на схема

Материал

В зависимости от применённого материала защитной рубашки, защита может производиться посредством следующих видов устройств:

  1. Фарфоровых – наиболее распространённая разновидность. Керамика устойчива к ультрафиолетовому излучению, поэтому может свободно применяться на открытых установках. Благодаря большой механической прочности, такие элементы могут одновременно выполнять роль опорной конструкции. К недостаткам следует отнести большой вес и хрупкость, что грозит травмами персонала при разлёте осколков в результате разрушения элемента.
  2. Полимерных – в качестве материала наружного покрытия используется каучук, винил и другие искусственные составы. Данные устройства не поддаются воздействию влаги, обладают меньшим весом и хорошими диэлектрическими свойствами, способны выдерживать значительные механические воздействия, но накапливают на поверхности атмосферную влагу и плохо реагируют на солнечный свет.
  3. Одноколонковых – в виде полупроводникового элемента с нелинейными характеристиками напряжения, с количеством дисков, в зависимости от категории оборудования.
  4. Многоколонковых – используются на высоковольтном оборудовании и состоят из нескольких компонентов, объединённых в единый узел. Отличаются повышенной надёжностью и способностью реагировать на различные характеристики нагрузки.

Выбор вида ОПН зависит от параметров оборудования и условий его эксплуатации.

Технические характеристики

Конкретная модель отличается следующими техническими характеристиками:

  • временем срабатывания – в зависимости от скорости реакции на перепад напряжения;
  • рабочим напряжением – значением данной величины, при которой элемент способен функционировать без разрушения на определённый временной промежуток;
  • номинальным повышенным напряжением – величиной, которую изделие способно выдержать в течение 10 секунд;
  • током утечки – от воздействия напряжения на ОПН и зависит от омического сопротивления элемента. Значение указанной характеристики – в сотых или тысячных долях ампер, перетекающих по защитному покрытию и полупроводниковому элементу;
  • разрядным током – значение при импульсном скачке напряжения;
  • устойчивостью к току волны перенапряжения – способностью не подвергаться разрушению при воздействии повышенного напряжения.

ОПН стандартизированы по величине указанных характеристик.

Применение и требования к эксплуатации

Указанные защитные устройства широко применяются для защиты линий электропередач, различных электроустановок промышленного назначения, трансформаторных подстанций, распределительных узлов. В быту ОПН используются для защиты вводных распределительных щитков или оборудования высокой ценности.

ОПН должны эксплуатироваться, согласно требованиям действующих правил и нормативов. Подбор устройств производится, исходя из особенностей эксплуатации и характеристик оборудования.

Техническое обслуживание

Данные ограничители не предусматривают разового применения и способны многократно выполнять свою защитную функцию, сбрасывая напряжение на заземлённую шину. Но в процессе эксплуатации элементы могут частично утрачивать рабочие характеристики, вплоть до полной негодности устройств.

Чтобы избежать внепланового выхода элементов из строя, в ходе эксплуатации они должны подвергаться плановым проверка и техническому обслуживанию, с контролем следующих параметров:

  • сопротивления – замеряется мегомметром, не реже 1 раза в каждые 6 лет;
  • тока проводимости – необходимость его проверки возникает при снижении отмеченной выше характеристики;
  • пробивного напряжения и герметичности – проводится перед пуском в работу новых устройств или в случае проведения заводского восстановительного ремонта;
  • тепловизионных измерений – по регламенту изготовителя и составленному на предприятии графику профилактических работ.

Также элементы осматриваются на предмет наличия внешних дефектов в виде подгораний, скопления пыли и загрязнений, разрушения изоляционного покрытия.

Использование ОПН позволяет обеспечить штатную работу электрического оборудования, исключив опасность его повреждения при резких скачках напряжения. Но указанные ограничители должны правильно выбираться и проходить регламентированное обслуживание, для их сохранности и продления срока службы.

Инструмент обозначения позиции

Автоматический инструмент обозначения позиции (PDT)

Правильное назначение должности - основа эффективной и последовательной программы обеспечения соответствия требованиям и безопасности персонала. Чтобы обеспечить систематический, надежный и единообразный способ определения должности, OPM в сотрудничестве с Управлением контрразведки и безопасности обороны (DCSA) предоставляет автоматизированный инструмент определения местоположения (PDT) для тех лиц в агентствах, на которые возложены обязанности по назначению должности.

проблемы? Функциональная помощь PDT: (724) 794-5612, добавочный 4600, опция 6

Обновленная версия средства определения позиции (PDT) теперь доступна как часть дополнительных выпусков продукта NBIS. Он имеет те же шаги и функции, что и текущий PDT, но со следующими новыми преимуществами:

  • Разработан для бесшовной интеграции с текущими и будущими услугами NBIS
  • Разработано с использованием более гибкого подхода к регистрации и доставке запросов на изменение PDT
  • На первом этапе PDT теперь отображается раскрывающийся список с названиями агентств
  • Предоставляет сводку обозначений в формате PDF для сохранения и размещения с описанием основной позиции
  • Стиль шрифта упрощает чтение текста на странице

Краткое руководство по изменениям в PDT см. В этом коротком информационном видео:

https: // youtu.be / LCrT_C_OIwg

Примечание. Агентства должны соблюдать стандарты, установленные OPM и Управлением директора национальной разведки (ODNI) для надлежащего определения прикрываемых должностей. OPM в сотрудничестве с ODNI предлагает агентствам инструктаж и обучение по применению Системы назначения должностей. Агентства должны иметь возможность продемонстрировать, что они придерживаются стандартов для надлежащего назначения должностей. Несоблюдение может привести к неблагоприятным результатам аудита в соответствии с разделом 5 USC § 1104 (b) (2) и 5 ​​CFR 5.2, или отзыв делегированных полномочий в соответствии с 5 CFR 731.103 (f).

Система обозначения позиции (PDS)

Система определения должности оценивает обязанности и ответственность должности, чтобы определить степень потенциального ущерба эффективности или целостности службы в результате неправомерного поведения должностного лица, занимающего должность. Это устанавливает уровень риска данной позиции. Эта оценка также определяет, представляют ли обязанности и ответственность должности потенциал для должностных лиц, чтобы оказать существенное неблагоприятное воздействие на национальную безопасность, и степень этого потенциального воздействия, которая устанавливает уровень чувствительности должности.Результаты этой оценки определяют, какой уровень расследования следует провести в отношении должности.

Перед использованием PDT назначенные лица должны сначала хорошо ознакомиться и понять PDS. Успех и последовательность PDT напрямую связаны с пониманием пользователем различных возможных вариантов выбора, связанных с требованиями, обязанностями и обязанностями национальной безопасности и пригодности (общественное доверие), доступными в рамках PDS. Без полного понимания возможных вариантов выбора пользователи могут случайно не сделать соответствующий выбор на ранней стадии процесса PDT, и это повлияет на точность окончательного обозначения местоположения. Полное понимание PDS и правильное применение PDT обеспечат последовательность.

Если у вас есть вопросы по назначению должности, обращайтесь в службу оценки пригодности по телефону (724) 794-5612, добавочный 7400. Если вас интересует обучение по назначению должности, просмотрите наш курс обучения для агентств.

Федеральные правила

Части 1400 и 731 Раздела 5 Свода федеральных нормативных актов устанавливают требования к агентствам по оценке соответствующих охваченных позиций на предмет чувствительности позиции и определения риска позиции, соизмеримого с обязанностями и ответственностью этих должностей.В частности, в разделе 1400.101 (d) говорится: «Все должности должны быть оценены для определения чувствительности должности, соизмеримой с обязанностями и назначениями должности, поскольку они связаны с влиянием на национальную безопасность, включая, помимо прочего, право на доступ к секретным Информация." В разделе 731.106 (a) Раздела 5 Свода федеральных нормативных актов говорится, что «руководители агентств должны назначать каждую покрываемую должность в агентстве с высоким, умеренным или низким уровнем риска, что определяется потенциалом должности для отрицательного воздействия на эффективность или целостность. службы.«Кроме того, в каждой части содержится перекрестная ссылка на требования к обозначениям риска и чувствительности. См. Разделы 1400.201 (c) и (d) и раздел 731.106 (c) (2).

Основные сведения о схемах символов P&ID - функциональная идентификация и условные обозначения

Функциональная идентификация и соглашения об именах

Загрузите бесплатный PDF-файл о функциональной идентификации P&ID и соглашениях об именах!

Мы подготовили этот полный pdf-файл, чтобы у вас была вся информация, которую мы приводим в этой статье, и вы могли ею поделиться, обсудите это с коллегами и используйте профессионально.

Мы считаем, что лучше иметь хорошо отформатированный текст, включающий все ключевые концепции, изложенные в этой публикации, готовый к использованию. поделитесь или сохраните для дальнейшего использования.

Запрос

Если вам интересно узнать больше о таких предметах, как Цель, Владелец и Содержание и условности . прочтите наше бесплатное введение в эти концепции в нашей статье Основы схемы P&ID. Часть 1. Назначение, владелец и содержание.

Если вам интересно узнать больше о таких предметах, как стандарты и рекомендации , прочитайте наше бесплатное введение в эти концепции в нашей статье. Основы диаграмм P&ID Часть 2 Международные стандарты.


P и ID Функциональная идентификация и соглашение об именах

Инженеры любят, когда рисуют и создают контуры своих идей .

Обычно необходимо уметь объяснить ваши идеи вашим клиентам или сотрудникам . Часто мы используем чертежей от до , чтобы объяснить идею , что в противном случае потребует много слов для объяснения .

За годы работы инженером по автоматизации я сделал несколько хороших чертежей , которые помогли мне лучше объяснить мои идеи .

После рисунок выполнен , необходимо идентифицировать элементы присутствуют на диаграмме P&ID , чтобы связать их с реальностью . Именно об этой концепции и идет речь в данной статье.


Тег поля

Эта третья статья о схемах P&ID посвящена функциональной идентификации и соглашения при наименовании элементов, представленных на диаграмме P&ID .

Причина довольно проста, пользователей КИПиА нуждаются в каком-либо методе для идентификации оборудования чтобы они могли управлять проектированием, закупками, установкой и обслуживанием этих систем.

Но идентификация должна соответствовать некоторым основным правилам , чтобы иметь хорошую документацию . Хорошая документация является основой для хорошего инжиниринга, и хорошего обслуживания объектов.

Стандарт идентификации элементов, подключенных к АСУ ТП, для большинства промышленных установок основан на ISA-5.1.

Однако иногда вы обнаружите, что добавляется дополнительная информация или интересные интерпретации, чтобы лучше определить местные требования , чтобы соответствовать особым требованиям системы или даже поддерживать традиции сайта.

Очень важно, чтобы стандарты , используемые на ваших предприятиях, были полностью определены, а строго следовали . Руководство по маркировке должно быть единообразным по всему предприятию.

Кроме того, у большинства крупных компаний есть свои собственных внутренних стандартов . Хотя между ними есть много различий в деталях, Основные символы и структура буквенного кода по существу идентичны . Если стандарт, установленный на заводе, не установлен, символика обычно основана на стандарте ISA-5.1-1984 (R1992)

Есть несколько национальных стандартов которые относятся к представлению контрольно-измерительных приборов и схем управления .Наиболее важными из англоязычных являются BS 1646 и ISA S5.1.

Процесс маркировки - это хорошо документированный процесс, определенный в нескольких стандартах, типичный номер тега состоит из двух частей:


Маркировка функциональной идентификации P&ID
  • функциональная идентификация или префикс
  • и номер цикла или суффикс

В зависимости от обстоятельств второй набор букв используется для индикации и записи. Их также можно использовать как существительное, глагол или прилагательное, и в этом случае они появятся в тексте или речи как индикатор, средство записи, указание и запись.

Двухэлементная схема нумерации соответствует следующему формату:


Тег

где XXXX - это префикс тега , который указывает функцию, а YYYY - это последовательный идентификатор, делающий тег уникальным.

Иногда для обозначения области процесса вставляется средний элемент, например номер здания или обозначение технологического материала.


3.1 Префикс

Префикс - важная часть идентификатора. В большинстве методов маркировки p и id, связанных со стандартами, буквы префикса тега зависят от позиции.

Первая буква указывает на физическое свойство, которое измеряется или контролируется (например, давление, расход, температура). Первая буква номера тега обычно выбирается так, чтобы она указывала на измеряемую переменную контура управления.


Пример основы схемы P&ID

В образце P&ID диаграммы , показанном на приведенном выше рисунке, F - первая буква в номере тега , который используется для приборов в контуре управления потоком .Функциональный идентификатор состоит из первой буквы (обозначающей измеряемой или инициирующей переменной ; например, F для расхода, T для температуры и т. Д.).

Вторая или третья буквы - модификаторы. На приведенном выше рисунке буква F в первой позиции указывает на элемент управления потоком. FT в крайнем левом кружке указывает на то, что это расходомер .FC - это контроллер потока , Символ FY - это датчик I / P , а FV - это клапан регулирования расхода .

Линия, пересекающая центр символа баллона FC, указывает на то, что контроллер установлен на передней панели главной панели управления или DCS. Отсутствие линии указывает на полевой прибор, а две линии означают, что прибор установлен на локальной или полевой панели.Пунктирными линиями показано, что прибор установлен внутри панели.

Типичные комбинации p & id letter показаны в следующей таблице , таблица основана на ISA-5.1-1984 (R1992) :


Коэффициент
ПЕРВОЕ ПИСЬМО ПОСЛЕДУЮЩИЕ ПИСЬМА

ИЗМЕРЕННАЯ ИЛИ НАЧАЛЬНАЯ ПЕРЕМЕННАЯ

МОДИФИКАТОР

ЧТЕНИЕ ИЛИ ПАССИВНАЯ ФУНКЦИЯ

ВЫХОДНАЯ ФУНКЦИЯ

МОДИФИКАТОР

А Анализ (5,19) Сигнализация
B Горелка горения Выбор пользователей (1) Выбор пользователей (1) Выбор пользователей (1)
К Электропроводность Контроль (13) Закрыть
D Плотность / Sp. Гравитация Дифференциал (4) Отклонение
E Напряжение Датчик (первичный элемент)
ESD Аварийное отключение
Факс Расход Передаточное число (фракция) (4)
G Измерение Смотровое стекло, смотровое устройство (9)
H Ручная (ручная) Высокая (7, 15, 16)
HH Высокая Высокая
I Ток (электрические) Укажите (10)
Дж Мощность Скан (7,24)
К Время, График Скорость изменения во времени (4,21) Пульт управления (22)
л уровень Легкий пилот (11) Низкий (7,15,16)
LL Низкая Низкая
м Влажность Мгновенный (4, 25) Средний, средний (7,15)
N Выбор пользователей (1) Выбор пользователей (1) Выбор пользователей (1) Выбор пользователей (1)
O Выбор пользователей (1) Отверстие, ограничение (23) Открыть
п. Давление, вакуум Точка (тестовое) соединение (26)
Q Количество / событие Интегрировать, суммировать (4)
R Радиация Запись или печать (17)
S Скорость, Частота Безопасность (8) Переключатель (13)
Т Температура Передача (18)
U Многопараметрическая (6) Многофункциональный (12) Многофункциональный (12) Многофункциональный (12)
В Вязкость, вибрация, механический анализ (19) Клапан, демпфер, жалюзи (13)
Вт Масса, усилие Колодец или карман
X Несекретный (2) Ось X Несекретный (2) Несекретный (2) Несекретный (2)
Y Событие, состояние или присутствие (20) Ось Y Реле, вычисление, преобразование (13, 14, 18)
Z Положение, размер Ось Z Привод, привод, неклассифицированный конечный элемент управления


ПРИМЕЧАНИЯ:


  • 4. Первая буква, используемая с модификатором, рассматривается как первая буква. Пример: TDI для дифференциальной температуры.
  • 5. Чтобы охватить весь анализ, не описанный в письме с выбором пользователя. Тип анализа должен быть определен за пределами всплывающей подсказки.
  • 6. Используется вместо комбинации первых букв. Обычно используется для многоточечных регистраторов / индикаторов.
  • 7. Использование этих модификаторов необязательно.Пример: буквы H и L могут быть опущены в неопределенном случае.
  • 8. Для закрытия только первичных элементов аварийной защиты, таких как разрывная мембрана (PSE), и оконечных элементов аварийной защиты, таких как предохранительный клапан (PSV).
  • 9. Относится к приборам, которые обеспечивают неоткалиброванное изображение, таким как уровнемер со смотровым стеклом (LG) и телевизионные мониторы.
  • 10. Обычно применяется к аналоговому или цифровому считыванию.
  • 11. Используется для контрольных ламп. Пример: ходовой свет двигателя может быть обозначен как EL или YL, в зависимости от того, является ли измеряемая величина напряжением или рабочим состоянием соответственно. Используется также для световой индикации процесса. Пример: свет высокого уровня (LLH).
  • 12. Используется вместо комбинации других функциональных букв.
  • 13. Используется для переключателей с ручным приводом или двухпозиционных контроллеров.Неверно использовать следующие буквы CV для чего-либо, кроме самоуправляемого регулирующего клапана.
  • 14. Используется в основном для электромагнитных устройств и реле. Для других целей значение должно быть определено за пределами облачка тегов.
  • 15. Эти модифицирующие члены соответствуют значениям измеряемой переменной, а не значениям сигнала. Пример: высокий уровень от уровнемера обратного действия должен быть LAH.
  • 16.Термины «высокий» и «низкий» применительно к положениям клапанов обозначают соответственно открытое и закрытое положения.
  • 17. Применимо к любой форме постоянного хранения информации.
  • 18. Используется для термина "передатчик".
  • 19. Используется для выполнения машинного анализа (где буква A выполняет более общий анализ). За исключением вибрации, значение должно быть определено за пределами всплывающей подсказки.
  • 20.Не использовать, когда ответные меры управления или мониторинга рассчитаны по времени или по расписанию.
  • 21. Для обозначения скорости изменения измеряемой переменной во времени. Пример: WKIC означает контроллер, показывающий скорость потери веса.
  • 22. Используется для обозначения станции управления оператора, такой как станция ручной загрузки (HIK), или операторского интерфейса распределенной системы управления.
  • 23. Используется также для обозначения ограничивающей диафрагмы (FO).
  • 24. Используется также для обозначения регистратора температурного сканирования (TJR).
  • 25. Используется также для обозначения ручного переключателя без фиксации (HMS).
  • 26. Например, контрольная точка анализа обозначена как AP.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ПРАВИЛА:


  • Есть нескольких букв - C, D, G, M, N, O, , которые могут быть , заданные пользователем .
  • Второй столбец, обозначенный Модификатор , добавляет дополнительной информации о к первой букве , переменной процесса. Например, если прибор используется для измерения разницы между двумя давлениями, возможно, давление на входе и выходе фильтр-пресса, P для давления используется как первая буква, а D для разницы в качестве модификатора второй буквы. Когда измеряется мгновенный расход и сумматор добавлен, чтобы обеспечить общий поток с течением времени, идентификатор устройства - FQ.Первая буква имени тега - F для потока, а вторая буква - Q из второго столбца, означает интегрировать или суммировать.
  • Следующие три столбца, следующие за , определяют , устройство , . первые из этих обозначают , считывание или пассивную функцию .
  • Значения нужно определять только один раз . Письмо о выборе пользователем предназначено для обозначения неуказанных значений, которые будут многократно использоваться в конкретном проекте. Если используется, буква может иметь одно значение как первая буква и другое значение как последующая буква. Значения должны быть определены только один раз в легенде или другом месте для этого проекта.
  • S как вторая буква может быть модификатором первой буквы или может быть классифицирована как последующая буква. Это может немного сбивать с толку. Если S используется в качестве следующей буквы, это относится к первичным элементам аварийной защиты.В этом случае устройство, обычно обозначаемое как PCV, также может быть помечено как PSV, если оно используется в качестве устройства безопасности. Термин xCV означает регулирующий клапан с автоматическим приводом, такой как регулятор давления. Последующую буквенную комбинацию CV не следует использовать в случаях, когда клапан не является самоприводным. Если буква S используется в качестве следующей буквы, например, в LSH, она обозначает переключатель. Вот как определить разницу: если рассматриваемое устройство генерирует дискретный (вкл / выкл) сигнал, тогда S во втором положении указывает, что устройство является переключателем; если устройство реагирует на изменяющиеся условия процесса, то S означает функцию безопасности.
  • Использование X для первой буквы - особый случай . Из ISA-5.1 неклассифицированная буква X предназначена для обозначения неуказанных значений, которые будут использоваться только один раз или использоваться в ограниченном объеме. Если используется, буква может иметь любое количество значений. При правильном применении буква X не появляется часто только один раз или в ограниченной степени. Вместо, определяемые пользователем буквы следует использовать для устройств, которые появляются регулярно, даже если нечасто.Таким образом, на многих современных промышленных объектах X может не понадобиться, поскольку большинство устройств появляются с некоторой регулярностью. Для тех из вас, у кого есть весь объект, заполненный передатчиками XT или XY, не беспокойтесь, это положение ISA-5.1 часто игнорируется. Неклассифицированная буква X предназначена для обозначения неуказанных значений, которые будут использоваться только один раз или использоваться в ограниченном объеме. Если используется, буква может иметь любое количество значений в качестве первой буквы и любое количество значений в качестве следующей буквы.За исключением использования отличительных символов, ожидается, что значения будут определены за пределами кружка с тегами на блок-схеме.
  • Грамматическая форма может быть изменена при необходимости . Пример: «Указать» может означать индикатор или указание.
  • Многие сайты будут использовать ISA-5.1 в качестве отправной точки .
  • Конечно, пользователь должен четко задокументировать указанные значения на листе условных обозначений P&ID , и эти значения должны быть сохранены, без двусмысленности и изменений для всего предприятия или, в идеале, для всей компании. После этого можно изменить таблицу легенды , чтобы включить в нее присвоенные буквенные обозначения , или даже специально определите приемлемые или стандартные буквенные комбинации для объекта.
  • Использование будет зависеть от контекста . В зависимости от обстоятельств третьи буквы Control, Transmit и Compute также могут использоваться как глагол или существительное, в этом случае они будут отображаться в тексте или речи как «Контроллер», «Передатчик» и «Компьютер» соответственно.

Ниже приведены некоторые из наиболее распространенных сокращений p & id в качестве префикса:


Примеры тегов P&ID
  • PIC = Контроллер индикации давления (индикатор)
  • LR = Регистратор уровня
  • TT = датчик температуры
  • DAH = сигнал тревоги высокой плотности
  • DAHH = Высокий уровень сигнала тревоги плотности
  • LSHH = реле уровня high-high
  • LSH = реле высокого уровня
  • LSL = реле низкого уровня
  • LSLL = реле уровня низкий-низкий
  • LAL = аварийный сигнал низкого уровня
  • PT = датчик давления
  • PDT = датчик перепада давления
  • AT = передатчик анализатора
  • TE = элемент температуры
  • TT = преобразователь температуры
  • PDSH = реле перепада давления высокого давления
  • KQL = время, количество света (т. е.е., время истекло)
  • PY = датчик давления
  • ZSO = позиционный переключатель (разомкнут)
  • HV = ручной клапан
  • HS = ручной переключатель

3.1.1 Типичные комбинации букв P&ID

Расширенная таблица типовых сочетаний букв для КИП:


Типичные сочетания букв P&ID

3.2 Суффикс


3.2.1 Номер цикла на основе

  • В дополнение к буквам группа проектирования КИПиА присваивает каждой функции порядковый номер. Все устройства в этой функции имеют один и тот же порядковый номер - номер петли. Единый номер шлейфа используется для идентификации устройств, которые выполняют одиночный конкретное действие, как правило, вход и выход для управления P и ID, вход для индикации переменной процесса или ручной выход.
  • Этот номер в сочетании с буквенным обозначением однозначно идентифицирует каждое устройство в этом наборе.
  • Нумерация элементов соответствует некоторым заводским соглашениям.
  • Есть два подхода, последовательный и параллельный, из которых последовательный является наиболее распространенным.
  • Последовательно каждому каналу, петле или схеме присваивается уникальный номер, например 47. Независимо от буквенного кода, все его элементы имеют одинаковый номер.Последовательным способом с использованием единой числовой последовательности для всех устройств. Следовательно, могут быть FRC-101, LR-102, PIC-103 и TI-104.
  • Блоки номеров распределяются параллельно в соответствии с типом или функцией прибора, в зависимости от его буквенного кода. Это приводит к тому, что одинаковые элементы в разных циклах имеют смежные номера. Эти числа могут соответствовать предложениям в ISA-5.1. Параллельно означает начало новой числовой последовательности для каждой первой буквы.Следовательно, могут быть FRC-101, PIC-101 и TI-101.

3.2.2 Расположение на основе номера

  • Первая цифра номера может указывать на номер завода; следовательно, FT-102 - это прибор на заводе 1.
  • Другой метод определения местоположения прибора - с помощью префикса, например: 2 (область), или 03 (единица измерения), или 004 (объект 4), который определяет зону обслуживания контура: 2-FT-102 - это петля 102 в области 2, или 03-FT-102 - это петля 102 в блоке 03, или 004-FT-102 - это петля 102 в установке 4.
  • Эти числа также можно объединить, чтобы показать площадь-единицу-установку одним числом: 234-FT-102 - датчик потока в контуре 102, который обслуживает зону 2, установку 3 и установку 4.
  • Чтобы полностью сбить с толку, помните, что номер цикла определяет элементы в цикле, поэтому цикл может обслуживать область, указанную выше, но конкретное устройство может физически находиться в другой области.

3.2.3 Номер схемы P&ID на основе

  • Разновидностью этой системы является привязка номеров P&ID к определенной области, а затем последовательная нумерация приборов на этом листе P&ID. Например, P&ID 25 поддерживает до 100 петель или номера петель прибора от 2500 до 2599.
  • Элегантность этой системы заключается в том, что вы можете найти правильный P&ID для прибора, основываясь только на номере тега, поскольку номер тега включает номер P&ID.
  • Часто номер области в любом случае вкладывается в номер P&ID, поэтому вы также узнаете область, обслуживаемую циклом, просто посмотрев на номер цикла.

3.2.4 Основное обозначение оборудования на основе

  • Назначение, которое появляется в месте номера контура на круге инструмента, является идентификатором оборудования, привязанным к таблице обозначений основного оборудования.
  • Условные обозначения, используемые для идентификации технологического оборудования:
    • Технологическое оборудование Общий формат XX-YZZ A / B
    • XX - идентификационные буквы для классификации оборудования.
      • C Компрессор или турбина
      • E Теплообменник
      • H Обогреватель
      • P Насос
      • R Реактор
      • T Башня
      • Резервуар для хранения ТК
      • V Емкость
    • Y обозначает участок на заводе
    • ZZ - это числовое обозначение для каждого элемента в классе оборудования A / B, идентифицирующее параллельные блоки или резервные блоки, не показанные на PFD.
  • Дополнительное описание оборудования дано поверх PFD.

Есть вопросы?

Если у вас есть какие-либо вопросы по этой статье, пожалуйста, свяжитесь с нами ... В любом случае вы можете заглянуть на нашу страницу часто задаваемых вопросов, там вы найдете ответы на самые распространенные вопросы.

Колледж дизайна Университета штата Айова

Мастер-класс OPN - 2018

В этом году мастер-класс был интенсивным четырехдневным семинаром по рисованию, организованным Нейраном Тураном.

В свете нашего текущего политического кризиса, связанного с изменением климата, какой вклад архитектура может внести в создание нового планетарного воображения нашей современной окружающей среды, помимо защиты окружающей среды или технологического детерминизма? Вместо того, чтобы ограничивать роль изменения климата для дизайна проблемой, которую необходимо решить, можем ли мы рассуждать об архитектуре как о мере, по которой можно было бы читать мир? Этот семинар является развитием этого вопроса, а также дисциплинарного и культурного потенциала такой провокации.

Позиционируя определенные проблемы, вызванные изменением климата, такие как добыча ресурсов, длительный период времени, геология, отходы и т. Д., С точки зрения архитектуры, семинар позиционирует изменение климата как культурную и политическую идею, требующую обновленного архитектурного воображения. На семинаре будет рассмотрен вопрос репрезентации в связи с изменением климата посредством дизайна диорам, которые изображают воображаемые изображения будущего в рамках вымышленного музея естественной истории, в котором представлены эпизоды добычи ресурсов и отходов.

С их непростым позиционированием между реальностью и вымыслом, а также их взаимодействием между двухмерным и трехмерным пространством, спроектированные диорамы мастерской будут не только представлять и отражать критические проблемы нашего нынешнего состояния, но, что, возможно, более важно , изменит взаимодействие архитектуры с миром через другой вид реализма. Расположенный как альтернатива гиперреализму (подумайте: правильное планирование сценария или экологическая инженерия данных и производительности в дизайне), гипер-сюрреализму (подумайте: архитектурная научная фантастика) или гиперабстракции (подумайте: белый шум), воркшоп рассмотрит возможности немного (не) знакомого реализма в архитектуре.То есть, ориентируясь на реальные события и факты текущих условий окружающей среды, проекты будут слегка абстрагироваться или лишать знакомых этих реалий, чтобы раздвинуть границы нашего общественного и дисциплинарного воображения об изменении климата с помощью архитектурного спекулятивного мышления.

привлеченных студентов:

Алекс Хохстетлер, Алисса Маллен, Крис Перес, Истон Сотман, Эрин Коупленд, Эван Джайлс, Хао Ван, Хаоран Чжэн, Накиса Дехпанах, Пол Джаспер, Сук Ли, Вентао Чжун, Ики Чжао, Уэйд Воллинк, Вейлун Джеймс, Дэниел Чен, Ливен, Томас Гетц, Ян Диллион, Джинки Гу, Кайхонг Гао, Алонсо Ортега, Наоми Ньольд, Ньяга Нджонджо, Стелла Хюнсео Ли

Орегон

Орегон

Портленд, Орегон


Portland International
Идентификатор ИКАО KPDX

Портленд, Орегон
Международный Портленд
Идентификатор ИКАО KPDX

н.э. 2.2 Географические и административные данные аэродрома
2.2.1 Контрольная точка: 45-35-19.3519N / 122-35-48.7299W
2.2.2 От города: в 4 милях к северо-востоку от ПОРТЛЕНДА, ИЛИ
2.2.3 Высота: 30,8 футов
2.2.5 Магнитное изменение: 16E (2010)
2.2.6 Контактное лицо в аэропорту: STEPHEN NAGY
7200 NE AIRPORT WAY
ПОРТЛЕНД, ИЛИ 97218 (503-415-6195)
2.2.7 Трафик: IFR / VFR

AD 2.3 График посещаемости
2.3.1 Все месяцы, все дни, все часы

AD 2.4 Услуги и оборудование по обработке
2.4.1 Оборудование для обработки грузов: ДА
2.4.2 Типы топлива: A, 100LL
2.4.5 Ангарное пространство: ДА
2.4.6 Ремонтные мощности: MAJOR

AD 2.6 Спасательные и противопожарные службы
2.6.1 Категория аэродрома для пожаротушения: Индекс ARFF IE сертифицирован 01.05.1973

AD 2.12 Физические характеристики взлетно-посадочной полосы
2.12.1 Обозначение : 21
2.12.2 Истинный пеленг: 225
2.12.3 Размеры: 6000 футов x 150 футов
2.12.4 PCN: 82 F / D / X / T
2.12.5 Координаты: 45-35-38.605N / 122-36-0.8463W
2.12.6 Высота порога: 26,4 фута
2.12.6 Высота зоны приземления: 26,4 фута

2.12.1 Обозначение: 03
2.12.2 Истинный пеленг: 45
2.12.3 Размеры: 6000 футов x 150 футов
2.12.4 PCN: 82 F / D / X / T
2.12.5 Координаты: 45-34-56.73N / 122-37-0.5188W
2.12,6 Высота порога: 22,2 фута
2.12.6 Высота зоны приземления: 22,9 фута

2.12.1 Обозначение: 10L
2.12.2 Истинный пеленг: 119
2.12.3 Размеры: 9825 футов x 150 футов
2.12.4 PCN: 133 F / D / W / T
2.12.5 Координаты: 45-35-47.454N / 122-36-0.0581W
2.12.6 Высота порога: 29,5 футов
2.12.6 Высота зоны приземления: 30,2 фута

2.12.1 Обозначение: 28R
2.12.2 Истинный пеленг: 299
2.12.3 Размеры: 9825 футов x 150 футов
2.12,4 PCN: 133 F / D / W / T
2.12.5 Координаты: 45-35-0.3785N / 122-33-59.2636W
2.12.6 Высота порога: 30,8 футов
2.12.6 Высота зоны приземления: 30,8 футов

2.12.1 Обозначение: 28L
2.12.2 Истинный пеленг: 299
2.12.3 Размеры: 11000 футов x 150 футов
2.12.4 PCN: 89 R / D / W / T
2.12.5 Координаты: 45-34-49.8531N / 122-35-2.0463W
2.12.6 Высота порога: 22,7 фута
2.12.6 Высота зоны приземления: 22.7 футов

2.12.1 Обозначение: 10R
2.12.2 Истинный пеленг: 119
2.12.3 Размеры: 11000 футов x 150 футов
2.12.4 PCN: 89 R / D / W / T
2.12.5 Координаты: 45-35-42.5347N / 122-37-17.3022W
2.12.6 Высота порога: 22,7 фута
2.12.6 Высота зоны приземления: 23,7 фута

AD 2.13 Заявленные расстояния
2.13.1 Обозначение: 21
2.13.2 Доступный разбег: 6000
2.13.3 Доступная взлетная дистанция: 6000
2.13.4 Доступная дистанция ускорения и остановки: 6000
2.13.5 Доступная посадочная дистанция: 6000

2.13.1 Обозначение: 03
2.13.2 Доступный разбег: 6000
2.13.3 Доступная взлетная дистанция: 6000
2.13.4 Доступная дистанция ускорения и остановки: 6000
2.13.5 Доступная посадочная дистанция: 6000

2.13.1 Обозначение: 10L
2.13.2 Доступный разбег: 9825
2.13.3 Доступная взлетная дистанция: 9825
2.13.4 Доступная дистанция ускорения и остановки: 9825
2.13.5 Доступная посадочная дистанция: 8535

2.13.1 Обозначение: 28R
2.13.2 Доступный разбег: 9825
2.13.3 Доступная взлетная дистанция: 9825
2.13.4 Доступная дистанция ускорения и остановки: 9825
2.13.5 Доступная посадочная дистанция: 9290

2.13.1 Обозначение: 28L
2.13.2 Доступный разбег: 11000
2.13.3 Доступная взлетная дистанция: 11000
2.13.4 Доступная дистанция ускорения и остановки: 11000
2.13.5 Доступная посадочная дистанция: 11000

2.13.1 Обозначение: 10R
2.13.2 Доступный разбег: 11000
2.13.3 Доступная взлетная дистанция: 11000
2.13.4 Доступная дистанция ускорения и остановки: 11000
2.13.5 Доступная посадочная дистанция: 11000

AD 2.14 Освещение захода на посадку и ВПП
2.14.1 Обозначение: 21
2.14.2 Система освещения приближения:
2.14.4 Система визуальной индикации уклона: P4R

2.14.1 Обозначение: 03
2.14.2 Система освещения приближения:
2.14.4 Система визуального индикатора уклона: P4L

2.14.1 Обозначение: 10L
2.14.2 Система огней приближения: MALSR
2.14.4 Система визуального указателя уклона: P4L

2.14.1 Обозначение: 28R
2.14.2 Система огней приближения: MALSR
2.14.4 Система визуальной индикации уклона захода на посадку: P4R

2.14.1 Обозначение: 28L
2.14.2 Система огней приближения: MALSR
2.14.4 Система визуального указателя уклона: P4L

2.14.1 Обозначение: 10R
2.14.2 Система огней приближения: ALSF2
2.14.4 Система визуальных индикаторов уклона захода на посадку: P4R

AD 2.18 Средства связи для обслуживания воздушного движения
2.18.1 Обозначение службы: AFRC OPS
2.18.3 Канал: 138.45
2.18.5 Часы работы:

2.18.1 Обозначение службы: AFRC OPS
2.18.3 Канал: 252.8
2.18.5 Часы работы:

2.18.1 Обозначение службы: ANG COMD POST (ВЫЗОВ ПЕНЬЯ В ГОРОД)
2.18.3 Канал: 288.9
2.18.5 Часы работы:

2.18.1 Обозначение службы: ANG OPS
2.18.3 Канал: 280,5
2.18.5 Часы работы:

2.18.1 Обозначение службы: ANG OPS
2.18.3 Канал: 281.2
2.18.5 Часы работы:

2.18.1 Сервисное обозначение: CD / P
2.18.3 Канал: 120.125
2.18.5 Часы работы: 24

2.18.1 Обозначение службы: CD / P
2.18.3 Канал: 318.1
2.18.5 Часы работы: 24

2.18.1 Обозначение службы: D-ATIS
2.18.3 Канал: 128.35
2.18.5 Часы работы: 24

2.18.1 Обозначение службы: D-ATIS
2.18.3 Канал: 269.9
2.18.5 Часы работы: 24

2.18.1 Сервисное обозначение: EMERG
2.18.3 Канал: 121,5
2.18.5 Часы работы:

2.18.1 Обозначение службы: EMERG
2.18.3 Канал: 243
2.18.5 Часы работы:

2.18.1 Обозначение службы: GND / P
2.18.3 Канал: 121.9
2.18.5 Часы работы: 24

2.18.1 Обозначение службы: GND / P
2.18.3 Канал: 348.6
2.18.5 Часы работы: 24

2.18.1 Обозначение службы: GND / S
2.18,3 канал: 132,275
2.18.5 Часы работы: 24

2.18.1 Обозначение службы: LCL / P (ВПП 10L / 28R)
2.18.3 Канал: 118.7
2.18.5 Часы работы: 24

2.18.1 Обозначение службы: LCL / P (ВПП 03/21, 10R / 28L)
2.18.3 Канал: 123.775
2.18.5 Часы работы: 24

2.18.1 Обозначение службы: LCL / P (ВПП 03/21, 10R / 28L)
2.18.3 Канал: 251,125
2.18.5 Часы работы: 24

2.18.1 Сервисное обозначение: LCL / P (ВПП 10L / 28R)
2.18.3 Канал: 257.8
2.18.5 Часы работы: 24

AD 2.19 Радионавигационные и посадочные средства
2.19.1 Тип ILS: DME для ВПП 21. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: GPO
2.19.5 Координаты: 45-34-47.97N / 122-37-7.94W
2.19.6 Высота площадки: 31 фут

2.19.1 Тип ILS: Курсор для взлетно-посадочной полосы 21. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: GPO
2.19.5 Координаты: 45-34-49.75N / 122-37-10.47W
2.19.6 Высота площадки: 11,4 фута

2.19.1 Тип ILS: DME для ВПП 10L. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: VDG
2.19.5 Координаты: 45-35-47.9502N / 122-36-13.551W
2.19.6 Высота площадки: 25,5 футов

2.19.1 Тип ILS: глиссада для взлетно-посадочной полосы 10L. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: VDG
2.19.5 Координаты: 45-35-39.7602N / 122-35-30.1707W
2.19,6 Высота площадки: 30,8 футов

2.19.1 Тип ILS: Курсор для взлетно-посадочной полосы 10L. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: VDG
2.19.5 Координаты: 45-34-55.53N / 122-33-46.85W
2.19.6 Высота площадки: 28,9 футов

2.19.1 Тип ILS: DME для ВПП 28R. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: IAP
2.19.5 Координаты: 45-35-47.95N / 122-36-13.551W
2.19.6 Высота площадки: 25,5 футов

2.19.1 Тип ILS: глиссада для ВПП 28R.Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: IAP
2.19.5 Координаты: 45-35-10.93N / 122-34-16.4W
2.19.6 Высота площадки: 30,1 фута

2.19.1 Тип ILS: Курсор для взлетно-посадочной полосы 28R. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: IAP
2.19.5 Координаты: 45-35-52.3N / 122-36-12.47W
2.19.6 Высота площадки: 25,6 футов

2.19.1 Тип ILS: DME для ВПП 10R. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: PDX
2.19.5 Координаты: 45-34-46.7386N / 122-34-45.2294W
2.19.6 Высота площадки: 36 футов

2.19.1 Тип ILS: глиссада для взлетно-посадочной полосы 10R. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: PDX
2.19.5 Координаты: 45-35-33.9026N / 122-37-7.2471W
2.19.6 Высота площадки: 16,1 футов

2.19.1 Тип ILS: Внутренний маркер взлетно-посадочной полосы 10R. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: PDX
2.19.5 Координаты: 45-35-46.7091N / 122-37-28.0266W
2.19.6 Высота площадки: 17 футов

2.19.1 Тип ILS: Курсор для взлетно-посадочной полосы 10R. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: PDX
2.19.5 Координаты: 45-34-43.5268N / 122-34-45.8188W
2.19.6 Высота площадки: 19,5 футов

2.19.1 Тип ILS: DME для ВПП 28L. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: JMJ
2.19.5 Координаты: 45-34-46.7386N / 122-34-45.2294W
2.19.6 Высота площадки: 36 футов

2.19.1 Тип ILS: глиссада для взлетно-посадочной полосы 28L. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: JMJ
2.19.5 Координаты: 45-34-52.6331N / 122-35-16.7121W
2.19.6 Высота площадки: 19,9 футов

2.19.1 Тип ILS: Курсор для взлетно-посадочной полосы 28L. Магнитное склонение: 16E
2.19.2 Идентификация ILS: JMJ
2.19.5 Координаты: 45-35-50.5155N / 122-37-37.8096W
2.19.6 Высота площадки: 24,8 фута

Общие примечания:

FUEL - A (AIR BP - ATLANTIC AVIATION SVCS.C503-331-4220) J8 (MIL) (NC-100LL, A)

ПРОЧНОСТЬ ПОДШИПНИКА: ВПП 03-21 ST 175, RY 10L-28R ST175, RY 10R-28L ST175.

ACFT С РАЗмахом крыла БОЛЬШЕ 118 ФУТОВ ЗАПРЕЩАЕТСЯ ПОВОРАЧИВАТЬ ВОСТОК НА TWY C С ЮГО-ЗАПАДА НА TWY F, ЕСЛИ НЕ ПОД БУДУТ.

TWY T BTN ВЫХОДЫ B5 и B6 CLSD ДЛЯ ВСТРЕЧИ С РАЗмахом крыла, превышающим 118 футов.

МАСЛО - О-128-133-148 (MIL).

MISC: FLT УВЕДОМЛЕНИЕ SVC, ADCUS, AVBL.

ДЕЙСТВУЮТ ПРОЦЕДУРЫ СНИЖЕНИЯ ШУМА; ПОЗВОНИТЕ ПО ШУМУ ПО ТЕЛЕФОНУ 503-460-4100.ПРИБЫТИЯ RY 28L ЯВЛЯЮТСЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫМИ К ШУМУ, ОЖИДАЙТЕ APCH ДО 28R С ПЕРЕХОДОМ НА 28L.

ОБЛАСТЬ TWY T BTN M & E3 НЕ VSB FM TWR.

МИГРАЦИОННЫЕ И ЗИМНИЕ ПЛОЩАДКИ LRG WATERFOWL ON & INVOF APRT. СИЛЬНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ЧАЙКИ С СЕНТЯБРЯ ПО АПРЕЛЬ; ОЖИДАЙТЕ ВЫСОКОГО NMBR ПТИЦ В ГОДУ; КОНСУЛЬТАЦИИ CK LCL.

ANG: ДОПОЛНИТЕЛЬНУЮ ИНФОРМАЦИЮ ARPT см. На FLIP AP / 1. СУЩЕСТВУЕТ ОПАСНАЯ ПТИЦА. ЭТАП 1 МАЯ-ОКТЯБРЬ, ЭТАП II НОЯБРЬ-АПРЕЛЬ. ТЕКУЩИЕ УСЛОВИЯ BIRD WATCH не сообщаются на ATIS.

ACFT, УПОЛНОМОЧЕННЫЙ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СЕВЕРО-ЗАПАДНОЙ ПОГРУЗКИ, БУДУТ БУКСИРОВАННЫЙ К / ОТ ЭТОЙ ПОГРУЗКИ.

TWY T BTN TWY E3 и TWY B5 CLSD ДЛЯ ВХОДА С РАЗмахом крыла, превышающим 198 футов.

ASSC В ИСПОЛЬЗОВАНИИ. ЭКСПЛУАТАЦИЯ ТРАНСПОНДЕРОВ С РЕЖИМОМ СООБЩЕНИЯ НА ВЫСОТЕ И ADS-B (ПРИ НАЛИЧИИ), ВКЛЮЧЕННЫМ НА ВСЕХ ПОВЕРХНОСТЯХ АЭРОПОРТА.

TWY K BTN TWY V и TWY A4 CLSD ДЛЯ РАЗМЕРА КРЫЛА БОЛЕЕ 118 ФУТОВ.

ANG: ТОЛЬКО ШИНА PPR / OFFL. BASE OPS OPR 1500-2300Z ++ ПН-ПТ EXC HOL .; DSN 638-4390, C503-335-4390. CTC BASE OPS 15 МИН. ДО LDG И ПОСЛЕ DEP ON 281.2. ТРАНС-КВАРТАЛЫ НЕ АВБЛ. ВНИМАНИЕ: ОСВЕЩЕНИЕ ПЛОЩАДЕЙ НЕ СОВМЕСТИМО с NVD.NVD НЕ УПОЛНОМОЧЕНА ВО ВРЕМЯ ВОЗДУХА В ВКНТ-АФЛД.

ПОВОРОТ НА 180 ГРАДУСОВ ПРИ ACFT ВЕСОМ БОЛЕЕ 12500 ФУНТОВ ЗАПРЕЩЕНЫ НА 10L / 28R, 21.03RY И ВСЕХ TWYS.

TWY K BTN TWY A5 и TWY V CLSD, ЧТОБЫ ПРОЙТИ КРЫЛА БОЛЕЕ 168 ФУТОВ.

ЯСУ - 4 (А / М32А-86) (МС-11) 1 (МА-1А).

ЖИДКОСТЬ - LHOXRB.

(E94) WSFO / WSO / FW / RFC.

TWY M BTN TWY E & TWY T CLSD, ЧТОБЫ РАЗМЕР КРЫЛА БОЛЕЕ 118 ФУТОВ.

TWY V CLSD ДЛЯ РАБОТЫ С РАЗмахом крыла БОЛЬШЕ 168 ФУТОВ.ACFT С РАЗмахом крыла БОЛЬШЕ, ЧЕМ 118 ФУТОВ ЗАПРЕЩЕНО FM ПЕРЕКЛЮЧЕНИЕ WB НА TWY A FM TWY V, ЕСЛИ НЕ БУДУТ.

TWY C BTN TWY C6 И TWY C8 CLSD ДЛЯ РАБОТЫ С РАЗмахом крыла GTR БОЛЕЕ 180 ФУТОВ.

TWY A3 BTN TWY A & GA RAMP CLSD ДЛЯ ВХОДА С РАЗмахом крыла GTR БОЛЕЕ 135 ФУТОВ БЕЗ БУКСИРОВКИ.

ARPT CLSD ДЛЯ БЕЗПИТАНИЯ ACFT EXCP В EMERG.

НЕКОНТРОЛИРУЕМЫЙ TFC НА ПИРСОН-МЕСТО ВАНКУВЕР WA 3 NM W OF RY 10L THLD НА EXTDD CNTRLN.

НА ЗАПАДНОЙ ЗОНЕ ARM / DEARM НА TWY C ТАКСИ ЛЮБОГО ТИПА НЕ МОЖЕТ ПРОЙТИ ЗОНУ ARM / DEARM, КОГДА ОН ИСПОЛЬЗУЕТСЯ.

TWY C3 CLSD ДЛЯ ДОСТУПА С РАЗмахом крыла, равным или GTR, превышающим 79 футов.

TWY T BTN TWY E2 и TWY E3 CLSD ДЛЯ РАЗМЕРА КРЫЛА БОЛЕЕ 118 ФУТОВ.

TWY E3 CLSD ДЛЯ РАБОТЫ С РАЗмахом крыла GTR БОЛЕЕ 198 ФУТОВ.

TWY W CLSD ДЛЯ ДОСТУПА С РАЗМЕТОМ КРЫЛА GTR БОЛЕЕ 118 ФУТОВ БЕЗ БУКСИРОВКИ

PDX ИМЕЕТ FAC ОГРАНИЧЕНИЯ, ЧТО LMT ЕСТЬ ВОЗМОЖНОСТЬ РАЗМЕЩЕНИЯ DIVD FLTS И MNTN ARPT SAFE OPN ВО ВРЕМЯ IREG OPS. ACFT OPRS SHUD CTC THE ARPT DUTY MGR AT (503) 460-4236 TO COORD DIVD FLTS EXC В СЛУЧАЕ ОБЪЯВЛЕНИЯ IN-FLT EMERG.

NSTD ЖЕЛТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ТОЧЕК PRK И ЯЩИК ДЛЯ ИНСТРУМЕНТОВ EQPT LCTN, ОКРАШЕННЫЙ НА ПЛАТФОРМЕ. ПОЖАЛУЙСТА, CTC BASE OPS ИЛИ ЗАПРОСИТЕ СЛЕДУЙТЕ ЗА МНОЙ, ЕСЛИ НЕ ЗНАЕТЕ ПРОЦЕДУРЫ PANGB PRK.

Миксоидный EWSR1-DDIT3, ассоциированный с липосаркомой, избирательно подавляет остеобластную и хондроцитарную транскрипцию в мультипотентных мезенхимальных клетках

Фигура 2.

Слитый белок EWSR1-DDIT3 избирательно подавлял промоторные активности клон-специфичных маркерных генов в клетках C3h20T1 / 2, а также в hMSC.

( A ) Схема доменной структуры EWSR1, DDIT3 и EWSR1-DDIT3. Богатый SYQG, богатый Ser-Tyr-Gln-Gly трансактивирующий домен; RGG, области с множественными повторами Arg-Gly-Gly; RNP-CS, консенсусная последовательность рибонуклеопротеина; TAD, домен активации транскрипции; BR, домен димеризации, богатый основными аминокислотами; LZ, ДНК-связывающий домен лейциновой молнии. Звездочки (*) обозначают 27 аминокислотных остатков, происходящих из последовательностей ДНК перед сайтом начала трансляции DDIT3 (пунктирная линия), которые транслируются после слияния в рамке считывания с EWSR1.Стрелки указывают точки слияния. ( B – D ) Влияние экспрессионных векторов EWSR1-DDIT3, EWSR1 и DDIT3 на активность промотор-люциферазных конструкций Opn ( B ), Col11a2 ( C ) и Ppar-γ2 ( D ) Через 48 ч после трансфекции в клетки C3h20T1 / 2. EWSR1-DDIT3, но не его аналоги EWSR1 или DDIT3 дикого типа, подавляли активности промоторов Opn и Col11a2. Однако активность промотора Ppar-γ2 не подавлялась. Трансфекцию в двух экземплярах повторяли не менее трех раз, и результаты показаны в виде средних значений ± стандартная ошибка.Значения p , рассчитанные с помощью дисперсионного анализа, составили 0,001, 0,0159 и 0,005 для Opn, Col11a2 и Ppar-γ2 соответственно. Звездочки (*) указывают на статистическую значимость ( p <0,05) после апостериорного критерия Тьюки-Крамера. Н.С., не имеет значения. ( E – G ) Мезенхимальные стволовые клетки (hMSC), полученные из костного мозга человека, были приобретены у Lonza Corporation, Walkersville, MD, USA, и культивированы в среде для роста MSC (MSCGM-CD ™ BulletKit ™, Lonza) с пенициллином (100 Ед / мл), стрептомицин (100 мкг / мл) и амфотерицин B (0.25 мкг / мл) в 5% CO 2 при 37 ° C. Активность промотора Opn ( E ), Col11a2 ( F ) или Ppar-γ2 ( G ) анализировали из клеточных лизатов, экстрагированных из клеток, котрансфицированных контролем pFLAG-CMV4, EWSR1-DDIT3, EWSR1 или DDIT3 48 ч. после трансфекции. Эти конструкции котрансфицировали вектором внутреннего контроля (Renilla). Активность люциферазы выражали как относительную активность по отношению к активности репортерного вектора без промотора (pGL3 basic). Трансфекцию в двух экземплярах повторяли не менее трех раз, и результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка.Значения p , рассчитанные с помощью ANOVA, составили 0,0445, <0,0001 и 0,2846 для Opn, Col11a2 и Ppar-γ2 соответственно.

Подробнее »

Уровни интегрина β3 и CD44 определяют эффекты варианта сплайсинга OPN-a на рост клеток рака легких

ВВЕДЕНИЕ

Остеопонтин (OPN) - это многофункциональный фосфорилированный гликопротеин и индуцибельный маркер, секретируемый трансформированными злокачественными эпителиальными клетками [1]. Он экспрессируется в широком спектре клеток и регулирует многие биологические функции, включая иммунные ответы, ремоделирование тканей и васкуляризацию, посредством своего воздействия на два типа молекул клеточной адгезии: интегрины [2, 3] и CD44 [4, 5].OPN также участвует в опухолевой пролиферации [6, 7], выживании [8], адгезии [9, 10], миграции [11, 12], инвазии и ангиогенезе [13]. Повышенная экспрессия OPN связана со снижением прогрессирования и метастазирования в рак легких [14, 15], груди [11, 16], толстой кишки [17], печени [18], желудка [12] и простаты [19].

Было идентифицировано несколько изоформ транскриптов OPN, включая OPN-a (полноразмерная форма), OPN-b (без экзона 5) и OPN-c (без экзона 4) (рис. 1A) [20].Многочисленные исследования, посвященные роли этих изоформ в онкогенезе, дали противоречивые результаты. При раке молочной железы OPN-c более эффективен в усилении независимого от закрепления роста, чем OPN-a [21]. В клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы OPN-a и -b, но не OPN-c, индуцируют миграцию клеток в клетках SK-Hep1 с высокой миграционной способностью. Напротив, OPN-c, но не OPN-a, подавляет миграцию в клетках Hep3B. OPN-c также способствует образованию адгезионных очагов в клетках Hep3B [22]. В клетках рака предстательной железы PC-3 избыточная экспрессия OPN-b и OPN-c способствует онкогенезу [23].В клеточных линиях немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) OPN-a и OPN-b усиливают, в то время как OPN-c подавляет инвазию клеток. Более того, в то время как OPN-a усиливает, а OPN-c подавляет образование колоний, OPN-b имеет противоречивые эффекты [24].

Рисунок 1: Экспрессия OPN в клеточных линиях. A. Принципиальная схема изоформ OPN. OPN-a - это полноразмерная изоформа (314 а.о.), OPN-b не имеет экзона 5 (300 а.о.), а OPN-c отсутствует экзон 4 (287 а.о.). B. Двадцать мкг общего белка подвергали Вестерн-блоттингу.Экспрессия OPN была низкой в ​​нескольких высокоинвазивных клеточных линиях, включая CL1-5, CL1-5-F4, h2299 и A549. C. Экспрессия изоформ OPN в различных клеточных линиях рака легкого и образцах аденокарциномы легкого (AD). Контрольные полосы представляли собой смешанные изоформы, амплифицированные из конструкций OPN-a, OPN-b и OPN-c с помощью ПЦР.

Мы наблюдали, что 65% образцов НМРЛ экспрессируют высокие уровни белка OPN [25]. Преобладающей формой OPN, экспрессируемой в клеточных линиях рака легких и опухолях легких, является OPN-a.В отсутствие интегрина β3 (ITGβ3) OPN-a усиливает рост клеток посредством пути CD44 / NFκB. Когда уровни OPN-a низкие, ITGβ3 необходим для роста клеток рака легких CL1-5. Однако OPN-a ингибирует рост клеток рака легких в присутствии высоких уровней ITGβ3. Целью этого исследования было изучить влияние ITGβ3 и CD44, двух важных молекул, усиливающих рост, в клетках рака легких, на регуляторную роль OPN-a в росте клеток рака легкого.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сплайсинг OPN влияет на рост клеток рака легких

Сверхэкспрессия OPN участвует в росте опухоли и инвазии при различных раковых заболеваниях, включая рак легких.Однако ряд высокоинвазивных клеточных линий рака легких, таких как A549, h2299 и CL1-5, экспрессировали низкие уровни белка OPN (рис. 1B). Среди трех изоформ OPN OPN-a был изоформой с наиболее высокой экспрессией в клеточных линиях и опухолях рака легких (рис. 1C).

вариантов сплайсинга OPN-a, OPN-b и OPN-c были клонированы и временно трансфицированы в клетки CL1-5 и A549. Эти эктопически экспрессируемые белки OPN также секретировались в культуральную среду (рис. 2А). Чтобы определить влияние различных вариантов сплайсинга OPN на рост клеток, мы обрабатывали клетки CL1-5 кондиционированной средой (CM) из других клеток CL1-5, временно трансфицированных различными изоформами OPN.Неожиданно, клетки CL1-5, обработанные CM / OPN-a, имели более медленную скорость роста, чем клетки, обработанные средой, собранной из пустых векторных контролей (VC). Обработка CM, содержащая OPN-b или OPN-c, имела незначительный эффект или не оказывала никакого эффекта на рост клеток CL1-5 (рис. 2B). Мы также провели такой же эксперимент на клетках A549. Неожиданно, A549 CM / OPN-a не ингибировал рост клеток A549 (фиг. 2C). Возможно, что сверхэкспрессия OPN-a индуцирует секрецию различных молекул в клетках CL1-5 и A549, вызывая разные реакции роста клеток.Альтернативно, это несоответствие в действии OPN-a на рост клеток CL1-5 и A549 можно объяснить различиями в уровнях экспрессии рецептора или последующего эффектора. Таким образом, клетки CL1-5 и A549 обрабатывали CM, собранным из клеток CL1-5 (фигура 2D) или A549 (фигура 2E), экспрессирующих различные варианты сплайсинга OPN. CM / OPN-a из клеток CL1-5 или A549 подавлял рост клеток CL1-5, но не A549.

Рисунок 2: Влияние OPN-a на рост клеток. A. Сверхэкспрессированные варианты сплайсинга OPN секретировались в среду (CM) на аналогичных уровнях.VC представляет клетки, трансфицированные пустым вектором. B. CM из клеток CL1-5, временно трансфицированных различными вариантами сплайсинга OPN, или VC, использовали для лечения других клеток CL1-5. CM / OPN-a сильно ингибировал рост клеток CL1-5, в то время как CM, содержащий OPN-b или OPN-c, оказывал незначительное влияние или не имел никакого эффекта. Кратковременные изменения количества клеток определяли путем деления количества клеток через 24 часа на количество клеток через 0 часов. Относительное кратное изменение количества клеток рассчитывали путем деления каждого кратного изменения в клетках, обработанных CM / OPN, на кратное изменение в клетках CM / VC. * , p <0,05. C. CM, собранную из клеток A549, временно трансфицированных различными вариантами сплайсинга OPN, или VC, использовали для лечения других клеток A549. В отличие от клеток CL1-5, CM, содержащие OPN-a, OPN-b или OPN-c, не подавляли рост клеток A549. D. КМ , содержащий различные варианты сплайсинга OPN, собирали из клеток CL1-5 и использовали для обработки клеток CL1-5 и A549. CM / OPN-a из клеток CL1-5 ингибировал рост клеток CL1-5, но не A549. *** , п <0.001. E. CM, содержащий различные варианты сплайсинга OPN, собирали из клеток A549 и использовали для лечения клеток CL1-5 и A549. CM / OPN-a из клеток A549 ингибировал рост клеток CL1-5, но не клеток A549. ** , p <0,01. F. Экспрессия экзогенного OPN-a в стабильных клонах CL1-5. Все стабильные клоны CL1-5 / OPN-a показали низкую способность к формированию фокуса по сравнению с векторными контролями (VC). G. Стабильные клоны CL1-5, сверхэкспрессирующие OPN-a, показали более медленные темпы роста по сравнению с VC. * , p <0,05.

Затем мы провели скрининг клеток CL1-5, стабильно экспрессирующих OPN-a с помощью G418 (фиг. 2F), и выполнили анализы формирования фокуса и анализ роста клеток на OPN-стабильных клонах. В соответствии с результатами лечения CM, клетки CL1-5, стабильно экспрессирующие OPN-a, генерировали меньше и меньшие очаги по сравнению с клетками VC (рис. 2F). Кроме того, темпы роста были ниже в клетках CL1-5, эктопически экспрессирующих OPN-a (рис. 2G).

Чтобы дополнительно подтвердить, что OPN-a непосредственно подавляет рост клеток CL1-5, мы использовали Ni-NTA для очистки OPN-a от CM (рис. 3A).Как показано на фиг. 3B и 3C, очищенный OPN-a эффективно подавлял рост клеток CL1-5, но не A549. В совокупности эти результаты продемонстрировали, что OPN-a, но не OPN-b или OPN-c, обладает способностью ингибировать рост клеток. Однако OPN-a не подавлял рост всех клеток рака легких.

Фигура 3: Очищенный OPN-a ингибирует рост клеток CL1-5, но не клеток A549. A. Слитый белок OPN-a-Myc-His очищали с помощью Ni-NTA агарозы. Левая панель: загружали 10 мкг очищенного OPN-a.Правая панель, вестерн-блоттинг очищенного OPN-a (3 мкг) и CM / OPN-a (50 мкл), детектированного с помощью антитела против OPN (O17). B. Очищенный OPN-a снижает рост раковых клеток CL1-5. VC представляет собой обработку материала из контрольного стабильного клона CL1-5 / Vector с использованием того же процесса очистки. C. Очищенный OPN-a не влиял на рост клеток A549.

ITGβ3 участвует в опосредованном OPN-a ингибировании роста

Секретируемый OPN может связываться с различными интегринами и CD44 для активации сигнальных путей.Таким образом, мы провели ПЦР в реальном времени для обнаружения различий в экспрессии интегринов и CD44 в клетках CL1-5 и A549. Как показано на фиг. 4A, наиболее детектируемые интегрины и варианты CD44 были более высоко экспрессированы в клетках A549; однако экспрессия интегринов α4, α5 и β3 была выше в клетках CL1-5. Среди этих трех интегринов разница в экспрессии β3 была наибольшей между двумя типами клеток. Чтобы определить, играет ли ITGβ3 роль в индуцированном OPN-a ингибировании роста клеток CL1-5, мы снижали экспрессию ITGβ3 в стабильных клонах CL1-5 / OPN-a и CL1-5 / VC и отслеживали скорость их роста.Нокдаун экспрессии ITGβ3 усиливал рост в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a (фиг. 4B, сплошные линии). Аналогичным образом, родительские клетки CL1-5 с пониженной экспрессией ITGβ3, обработанные очищенным OPN-a, росли быстрее, чем родительские клетки CL1-5 с нормальной экспрессией ITGβ3 после такой же обработки (фиг. 4D). OPN-a также ингибировал рост клеток A549, сверхэкспрессирующих ITGβ3 (фиг. 4E). Кроме того, индуцированное OPN-a ингибирование роста также наблюдалось в клетках h560 и h2299, сверхэкспрессирующих ITGβ3 (фиг. 4G).Эти результаты продемонстрировали, что ITGβ3 необходим для ингибирования роста, индуцированного OPN-a. В отсутствие OPN-a ITGβ3 был необходим для роста клеток CL1-5 (фиг. 4B). Эффективность si-ITGβ3 в клетках CL1-5 и эктопическая экспрессия ITGβ3 показаны на фиг. 4F.

Фигура 4: ITGβ3 необходим для ингибирования роста, индуцированного OPN-a. A. Экспрессию различных мРНК интегрина и изоформ CD44 оценивали с помощью ПЦР в реальном времени с помощью ОТ. Уровни экспрессии интегрина α4, α5 и β3 были ниже в клетках A549, чем в клетках CL1-5.Разница в экспрессии ITGβ3 между клетками CL1-5 и A549 была наиболее значительной. * , p <0,05; ** , p <0,01, *** , p <0,001. B. Кривые роста стабильно экспрессирующих OPN-a клеток CL1-5, обработанных si-ITGβ3 или si-NC. Стабильный клон OPN-a (OPN-a / si-NC) рос медленнее, чем клетки VC / si-NC. Нокдаун ITGβ3 обращал индуцированное OPN-a ингибирование роста в клетках CL1-5 (OPN-a / si-ITGβ3). ITGβ3 также увеличивал рост клеток CL1-5 (сравнение между VC / si-NC и VC / si-ITGβ3). C. Эффективность si-ITGβ3 в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a измеряли с помощью ПЦР RT в реальном времени в клетках в (B). ** , p <0,01, *** , p <0,001. D. Клетки CL1-5, трансфицированные si-ITGβ3 или si-NC, обрабатывали очищенным OPN-a. Подобно нокдауну ITGβ3 в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a (B), нокдаун ITGβ3 в клетках CL1-5 обращал ингибирование роста, индуцированное OPN-a. * , p <0,05. E.Клетки A549, экзогенно экспрессирующие ITGβ3, обрабатывали очищенным OPN-a. Сверхэкспрессия ITGβ3 значительно снижает рост клеток A549, что позволяет предположить, что ITGβ3 необходим для ингибирования роста, индуцированного OPN-a. ** , p <0,01. F. Экспрессия белка ITGβ3 в клетках CL1-5 / si-ITGβ3 и A549 / ITGβ3 в (D и E). G. Очищенный OPN-a ингибировал рост клеток h560 / ITGβ3 и h2299 / ITGβ3, но не влиял на рост клеток h560 и h2299.

В отсутствие ITGβ3 OPN-a индуцирует рост клеток по пути CD44 / NFkB

В отсутствие ITGβ3 OPN-a усиливает рост клеток CL1-5 (фиг. 4B и 4D).Поскольку OPN связывается с различными интегринами и CD44, возможно, что OPN-a может связываться с другим рецептором для усиления роста в отсутствие ITGβ3. Таким образом, мы обрабатывали стабильные клоны CL1-5 / OPN-a и CL1-5 / VC, трансфицированные si-ITGβ3, различными ингибиторами сигнального пути для скрининга путей, участвующих в OPN-a-индуцированном росте в отсутствие ITGβ3. Ингибирование активности NFκB с помощью Bay-11-7082 блокировало OPN-a-индуцированный рост (фиг. 5A). Чтобы подтвердить этот результат, мы обрабатывали стабильные клоны CL1-5 / OPN-a и CL1-5 / VC, временно трансфицированные si-ITGβ3 или si-NC с помощью Bay-11-7082, и измеряли рост клеток.Как показано на фиг. 5B, нокдаун ITGβ3 в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a усиливал рост клеток (дорожки 5 и 7). Однако обработка 10 нМ Bay-11-7082 ингибировала OPN-a-индуцированный рост клеток CL1-5 / si-ITGβ3 (фиг. 5B, дорожки 7 и 8), но не подавляла рост клеток CL1-5 / VC независимо от экспрессии ITGβ3 (фиг. 5В, дорожки 1 и 2; дорожки 3 и 4). Нокдаун как ITGβ3, так и субъединицы p65 NFκB блокировал OPN-a-индуцированный рост в клетках CL1-5 (фиг. 5C, дорожки 5 и 6) по сравнению с клетками CL1-5 с выключением только ITGβ3 (дорожки 3 и 4).Эффективность si-ITGβ3 и si-p65 показана на Фигуре 5D.

Фигура 5: OPN-a индуцирует рост клеток после нокдауна ITGβ3 через путь CD44 / NFκB. A. Скрининг путей, участвующих в ингибировании роста, индуцированном OPN-a. Стабильно экспрессирующие OPN-a или пустые клетки вектора CL1-5 временно трансфицировали si-ITGβ3 и обрабатывали различными ингибиторами пути. Кратковременные изменения количества клеток определяли путем деления количества клеток через 48 часов на количество клеток через 0 часов. Относительное кратное изменение количества клеток рассчитывали путем деления каждого кратного изменения в клетках OPN / si-ITGβ3 на кратное изменение в клетках VC / si-ITGβ3 для каждой обработки ингибитором.Ингибитор NFκB Bay11-7082 в значительной степени подавлял рост клеток CL1-5 / OPN-a с индуцированным РНКи нокдауном ITGβ3. PD98059: ингибитор MAPK; SP600125: ингибитор JNK; U0126: ингибитор МЕКК; LY294002: ингибитор PI3K. B. Участие NFκB в ингибировании роста, индуцированном OPN-a. Стабильные клоны CL1-5 / OPN-a и CL1-5 / VC трансфицировали si-ITGβ3 или si-NC и обрабатывали 10 нМ Bay11-7082 или без него в течение 48 часов. Эктопическая экспрессия OPN-a снижает рост клеток (дорожки 1 и 5). Нокдаун ITGβ3 не только блокировал индуцированное OPN-a ингибирование роста, но также увеличивал рост клеток CL1-5 / OPN-a (дорожки 5 и 7).Обработка Bay11-7082 отменила это увеличение роста (дорожки 7 и 8). Количество клеток подсчитывали до (0 ч) и после (48 ч) обработки для расчета кратного изменения количества клеток. *** , p <0,001; ### , p <0,001; +++ , p <0,001. C. Участие p65 в ингибировании роста, индуцированном OPN-a. Клетки CL1-5 обрабатывали si-ITGβ3, si-p65 или si-ITGβ3 / si-p65 и инкубировали с / без 0.5 мкг / мл очищенного OPN-a в течение 24 часов. Очищенный OPN-a ингибировал рост клеток CL1-5 / si-NC (дорожки 1 и 2). После нокдауна ITGβ3 OPN-a увеличивал, а не ингибировал рост клеток (дорожки 1 и 2 и дорожки 3 и 4). Индуцированный siRNA нокдаун как ITGβ3, так и p65 устраняет это увеличение роста (дорожки 3 и 4 и 5 и 6), указывая на то, что NFκB необходим для OPN-a-индуцированного увеличения роста клеток CL1-5 / si-ITGβ3. Кратное изменение количества клеток рассчитывали с использованием количества клеток, подсчитанных до и после обработки OPN-a * , p <0.05; ** , p <0,01. D. Эффективность si-ITGβ3 (5 пмоль) и si-p65 (50 пмоль), измеренная с помощью вестерн-блоттинга в клетках в (C). E. Эффективность нокдауна si-ITGβ3 (5 пмоль) и si-CD44 (25 пмоль) в клетках CL1-5 в (F), измеренная с помощью ОТ ПЦР в реальном времени. ** , p <0,01; ***, р <0,001; ### , p <0,001. F. Нокдаун CD44 отменял индуцированное OPN-a увеличение роста клеток CL1-5 / si-ITGβ3.Очищенный OPN-a ингибировал рост клеток CL1-5 (дорожки 1 и 2), а нокдаун ITGβ3 усиливал рост клеток (дорожки 3 и 4). Нокдаун CD44 уменьшал это увеличение клеточного роста (дорожки 3 и 4 и дорожки 5 и 6). Кратное изменение количества клеток рассчитывали, используя количество клеток, подсчитанное до и после обработки OPN-a. * , p <0,05; ** , p <0,01; *** , p <0,001. G. Нокдаун ITGβ3 в клетках CL1-5 не только отменял индуцированное OPN-a ингибирование роста, но также увеличивал рост клеток (дорожки 1 и 2 и дорожки 3 и 4).Блокирование CD44 с помощью 0,5 мкг антитела CD44 снижает индуцированное OPN-a увеличение роста клеток CL1-5 / si-ITGβ3 (дорожки 3 и 4 и 5 и 6). IgG является отрицательным контролем для антитела CD44. * , p <0,05.

NFκB является последующим эффектором CD44 [26]. Чтобы определить, способствует ли OPN-a росту путем связывания с CD44 в отсутствие ITGβ3, мы заблокировали экспрессию CD44 в клетках CL1-5 / si-ITGβ3 с помощью РНКи (фиг. 5E) и исследовали влияние OPN-a на рост.Двойной нокдаун ITGβ3 и CD44 ингибировал OPN-a-индуцированный рост клеток (фиг. 5F, дорожки 5 и 6) по сравнению с клетками с нокдауном только ITGβ3 (фиг. 5F, дорожки 3 и 4), предполагая, что, когда экспрессия ITGβ3 снижается, OPN- Вместо этого a связывается с рецептором CD44 и усиливает рост клеток через сигнальный путь NFκB. Этот индуцированный OPN-a рост не происходил после нокдауна как CD44, так и ITGβ3. Чтобы подтвердить эти наблюдения, определяли влияние OPN-a на рост клеток CL1-5 / si-ITGβ3, когда для блокирования функции CD44 использовали антитело против CD44.Анти-CD44 снижал индуцированный OPN-a рост в отсутствие интегрина β3 (фиг. 5G, дорожки 3 и 4 и 5 и 6).

Для исследования влияния OPN-a на поверхностную экспрессию ITGβ3 необработанные клетки CL1-5 и клетки, обработанные 0,5 мкг / мл очищенного OPN-a, иммуноокрашивали анти-ITGβ3. Окрашивание ITGβ3 проявлялось в виде прерывистых сигналов флуоресценции в базальных срезах конфокальных изображений необработанных клеток CL1-5. Однако обработка OPN-a значительно уменьшила пунктурированные и общие сигналы ITGβ3 (фиг. 6A).В соответствии с этим открытием, клетки CL1-5, сверхэкспрессирующие OPN-a, имели более низкие уровни ITGβ3 (фиг. 6B). Кроме того, обработка OPN-a снижала фосфорилирование FAK, нижестоящего эффектора интегрина, предполагая, что обработка OPN-a ослабляла активность ITGβ3 (фиг. 6C). Когда присутствует ITGβ3, OPN-a не влияет на мембранное распределение CD44. Однако после подавления экспрессии ITGβ3 посредством si-РНК обработка OPN-a увеличивала мембранные уровни CD44 (фиг. 6D). Действительно, коиммунопреципитация OPN-a с CD44 была увеличена в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a по сравнению с клоном CL1-5 / VC (фигура 6F).Эти результаты предполагают, что связывание OPN-a с ITGβ3 снижает уровни ITGβ3 в точках фокусной адгезии или формирование очаговой адгезии. Когда уровни ITGβ3 были снижены, OPN-α связывался, стабилизировал и активировал локализованный на мембране альтернативный рецептор CD44. Таким образом, CD44, ITGβ3 и OPN-a взаимодействуют друг с другом, влияя на рост клеток CL1-5.

Фигура 6: Эффекты OPN-a на ITGβ3 и мембранное распределение CD44 в клетках CL1-5. A. Клетки CL1-5 обрабатывали OPN-a или без него и иммуноокрашивали антителом против ITGβ3.Окрашивание ITGβ3 проявлялось как пунктированные сигналы (стрелки) в базальном сечении конфокальных изображений в необработанных клетках; Обработка OPN-a значительно уменьшила как пунктурированные, так и общие сигналы. B. Экспрессия ITGβ3 была снижена в клетках, стабильно трансфицированных OPN-a, при Вестерн-блот-анализе. C. Фосфорилирование FAK Y576 было снижено в клетках CL1-5, обработанных 0,5 мкг / мл очищенного OPN-a, по сравнению с необработанными клетками. * , p <0,05. D. Клетки CL1-5, обработанные si-ITGβ3 или без него, инкубировали с / без очищенного OPN-a.Затем клетки иммуноокрашивали анти-CD44. Когда экспрессия ITGβ3 снижалась, очищенный OPN-a увеличивал локализованные на мембране уровни CD44. E. Эффективность si-ITGβ3 в клетках в (D). F. Повышенная коиммунопреципитация OPN-a с CD44 наблюдалась в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a по сравнению с клоном CL1-5 / VC.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты этого исследования показали, что OPN-a может как увеличивать, так и подавлять рост раковых клеток в зависимости от экспрессии его рецепторов.Уровни ITGβ3 и CD44 специфически определяют эффекты OPN-a на рост клеток рака легких. Клетки CL1-5 экспрессируют высокие уровни ITGβ3, тогда как клетки A549 экспрессируют низкие уровни ITGβ3. Оба этих типа клеток экспрессируют CD44, но уровни CD44 выше в клетках A549. Обработка OPN-a снижала рост клеток CL1-5, A549 / ITGβ3, h560 / ITGβ3 и h2299 / ITGβ3 по сравнению с необработанными клетками. Эти результаты предполагают, что ITGβ3 необходим для ингибирования роста, индуцированного OPN-a. Иммуноокрашивание показало, что обработка OPN-a значительно снижает мембранные и общие уровни ITGβ3.Возможно, что связывание OPN-a с ITGβ3 вызывает интернализацию и дестабилизацию ITGβ3, а также других связанных рецепторов роста.

Нокдаун экспрессии ITGβ3 в клетках CL1-5 не только отменял индуцированное OPN-a ингибирование роста, но также усиливал индуцированный OPN-a рост клеток. В отсутствие ITGβ3 OPN-a увеличивал рост клеток по пути CD44 / NFκB. В соответствии с этим результатом обработка OPN-a значительно повышала уровни CD44 в мембране после индуцированного si-РНК нокдауна ITGβ3.Основываясь на этих результатах, мы предполагаем, что в отсутствие OPN-a ITGβ3 увеличивает рост за счет связывания с фактором роста или активации рецептора роста (фигура 7A). Повышенные уровни OPN-a в окружающей среде блокируют связывание ITGβ3 с факторами роста, тем самым снижая рост клеток. Альтернативно, связывание OPN-a с ITGβ3 может приводить к интернализации ITGβ3, а также ассоциированных рецепторов роста, таким образом подавляя рост клеток. (Рисунок 7C). Напротив, когда уровни ITGβ3 низкие, OPN-a связывается, стабилизирует и активирует CD44, который, в свою очередь, активирует сигналы роста (фигура 7D).Наконец, в отсутствие OPN-a ITGβ3 необходим для роста клеток CL1-5 (фиг. 7B).

Фигура 7: Схематическая диаграмма регуляции роста, опосредованной OPN-a и ITGβ3. A. В отсутствие OPN-a ITGβ3 связывается с сигнальной молекулой (сигнал роста, молекула окружающей среды или рецептор роста) для поддержания роста клеток CL1-5. B. Нокдаун ITGβ3 снижает рост клеток. C. OPN-a может конкурировать с молекулами сигнала роста за связывание ITGβ3 или вызывать интернализацию ITGβ3 или комплекса ITGβ3 / рецептор роста, таким образом снижая рост клеток. D. Нокдаун ITGβ3 позволяет OPN-a связываться с альтернативным рецептором CD44, что увеличивает локализацию CD44 в мембране и увеличивает рост за счет активации NFκB.

OPN опосредует миграцию клеток через различные интегрины, включая αvβ1, αvβ3, αvβ5, α4β1, α5β1, α8β1 и α9β1 (обзор в [13]). Среди гетеродимеров интегрина αvβ3 чаще всего ассоциируется со злокачественными новообразованиями, индуцированными OPN. Комплекс αvβ3 участвует в индуцированной OPN миграции и инвазии в опухолевые клетки [27, 28], а также в индуцированной OPN миграции эндотелиальных клеток и ангиогенезе [29, 30].Кроме того, лигирование OPN с CD44 увеличивает клеточную адгезию, инвазию и трансформацию [13, 31]. OPN напрямую взаимодействует с интегрином β3 и CD44 [32, 33]; последовательности RGD и SVVYGLR в OPN ответственны за его взаимодействие с интегрином [34], в то время как сайты связывания CD44 в последовательности OPN еще не идентифицированы. Интересно, что OPN действует как связующая молекула между вариантами CD44 и интегринами, чтобы стимулировать подвижность в мышиных клетках [5]. Взаимодействие между OPN и αvβ3 увеличивает экспрессию CD44v6 в клетках HepG2 и усиливает клеточную адгезию к гиалуроновой кислоте [35].Кроме того, связывание OPN-a с вариантами CD44 активирует интегрины через Src, тем самым способствуя сигналам выживания, полученным из ECM, при раке желудка [36].

Хотя повышающая регуляция OPN в плазме или раковых тканях связана с плохим прогнозом рака, наши результаты ясно демонстрируют, что OPN-a, но не OPN-b или -c, снижает рост клеток CL1-5. Причина, по которой сверхэкспрессия OPN-α подавляет рост этих раковых клеток, неизвестна. OPN способствует миграции иммунных клеток к месту раны.Однако было показано, что ОПН, полученный из опухоли, подавляет функцию макрофагов и способствует росту опухоли [37]. Способность опухолевых клеток уклоняться от иммунитета хозяина может быть результатом снижения продукции NO макрофагами в ответ на ОПН, полученный из опухоли [38]. Также неизвестно влияние различных изоформ OPN на иммунитет. Вариант сплайсинга OPN-a, который наиболее сильно экспрессируется в опухолевых клетках, может помочь подавить иммунный надзор. Кроме того, мы обнаружили, что фибробласты, обработанные OPN-a, могут секретировать молекулы, которые усиливают рост клеток рака легких.(данные не показаны)

Наше исследование показало, что уровни экспрессии ITGβ3 и CD44 определяют, подавляет или усиливает OPN-a рост клеток рака легких. Кроме того, влияние ITGβ3 на рост раковых клеток определяется уровнями OPN в окружающей среде. OPN и ITGβ3 являются привлекательными мишенями для лечения рака, и целенаправленная терапия ITGβ3 (такая как циклический RGD) широко исследовалась. Наше исследование предполагает, что таргетная терапия ITGβ3 может эффективно подавлять рост OPN-отрицательных клеток, но также может увеличивать рост OPN-положительных клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток и лечение

Клеточные линии NCI-A549, NCI-h33, NCI-h541 и NCI-h2355 аденокарциномы легкого (AD), NCI-h458 и NCI-h2299 немелкоклеточного легкого рак (NSCLC) и линии клеток крупноклеточной карциномы легкого NCI-h560, NCI-H661 были получены из Центра сбора и исследования биоресурсов (BCRC, Тайвань). Линии клеток легкого AD CL1-0, CL1-3 и CL1-5 были любезно предоставлены доктором П.К. Янгом (кафедра внутренней медицины, Национальный университет Тайваня, Тайбэй, Тайвань).Для анализа роста клеток клетки A549 и h2299 поддерживали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки CL1-0, CL1-5 и h560 поддерживали в среде RPMI1640, содержащей 10% FBS. RPMI, DMEM и FBS были приобретены у Gibco.

Клонирование и трансфекция

OPN-a и -b амплифицировали с помощью ПЦР с кДНК CL1-0 и клонировали в векторы pcDNA ™ 3.1 / myc -His (-) A. Для получения OPN-c был проведен сайт-направленный мутагенез на основе ПЦР для удаления экзона 4 в конструкции OPN-a.ITGβ3 амплифицировали с помощью ПЦР (прямой праймер: 5’-GCGACGGTCCGGCCACCATGCGAGCGCGG-3 ’; обратный праймер: 5’-GCCACGGACCGCAGTGCCCCTGTACGTGAT-3’) из кДНК CL1-5 и лигировали с вектором T / A. После секвенирования ITGβ3 был субклонирован в сайт RsrII в pcDNA 3.1 / myc-His (-) A. Вектор pcDNA был сконструирован путем вставки адаптера с сайтом рестрикции RsrII (F 'oligo: 5'-GATCCGGTCCGCAC-3'; R 'oligo: 5'-GATCGTGCGGACCG-3') в сайт BamHI и был мутирован в сайте RsrII в гене Neo r . Трансфекцию проводили реагентом для трансфекции Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.Трансфицированные клетки CL1-5 обрабатывали G418 (500 мкг / мл) (Sigma-Aldrich) в течение 3-4 недель для отбора стабильных клонов. Для РНК-интерференции siRNA (si- ITGβ3 : 5'-GGACUACGCUCUCUGAAUUTT-3 ', si-CD44: 5'-UAUUCCACGUGGAGAAAAATT-3', si-p65: 5'-CCUUUCUCAUCCCAUCU, или si-p65: 5'-CCUUUCUCAUCCCAUCU, или si-p65: 5'-CCUUUCUCAUCCCAUCU, '-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' (предоставленный MDBio, Inc, Тайвань) трансфицировали в клеточные линии с использованием липофектамина, а затем клеточные линии культивировали в течение 24 часов. Затем трансфицированные клетки переносили в подходящую среду для анализа.

Вестерн-блоттинг

Клетки лизировали лизисным буфером, содержащим 0,5% NP-40, 50 мМ трис-Cl (pH 7,5), 1 мМ EDTA и коктейль ингибиторов протеазы (Roche) в течение 3 мин. Затем клеточный дебрис удаляли центрифугированием и определяли концентрацию белка с использованием набора для анализа белков Брэдфорда (Bio-Rad). Равные количества белка разделяли на гелях додецилсульфат-полиакриламид натрия (SDS-PAGE) и затем переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) (Perkin Elmer).После блокирования мембраны инкубировали с анти-Flag (Sigma), анти-OPN (# 10A16 или # O17, IBL10011, 18625.), анти-ITGβ3 (Abcam ab75872) или антителами против p65 (Millipore, 06-418). ) при 4 ° C в течение ночи с последующей инкубацией с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, при комнатной температуре в течение 1 часа. Блоты визуализировали с использованием набора для усиленной хемилюминесценции (ECL) (Perkin Elmer).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

клеток CL1-5 (3 × 10 5 клеток / лунку) высевали на 6-луночные планшеты и культивировали до 70% конфлюэнтности.Затем клетки трансфицировали si-NC или si-ITGβ3 или без них, используя липофектамин, и инкубировали в течение 24 часов. Трансфицированные клетки высевали (1,5 × 10 5 клеток) на покровные стекла. После 16-часовой инкубации клетки обрабатывали 0,5 мкг / мл OPN-a в течение 24 часов. Затем клетки фиксировали 100% метанолом в течение 10 минут при -20 ° C с последующим блокированием 3% BSA в течение еще 60 минут при комнатной температуре. Затем фиксированные клетки зондировали антителом против интегрина β3 (разведение 1: 200; Abcam ab75872) или CD44 (разведение 1: 200; GeneTex Gtx102111) в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей инкубацией с TRITC или F488-конъюгированной козой. антитела против кроличьего IgG (разведение 1: 500; Sigma, St.Луис, Миссури, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем клетки трижды промывали PBS, окрашивали DAPI в течение 15 мин и наносили на них монтажный раствор. Экспрессию и расположение целевых белков наблюдали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа.

Иммунопреципитация

Для иммунопреципитации CD44 5x10 6 CL1-5 / OPN-a клетки лизировали буфером RIPA (50 мМ Трис, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия, 2 мМ EDTA 2, 1 мМ PMSF, ингибитор протеазы и ингибитор фосфатазы).Лизат (1 мг белка) инкубировали с 4 мкг антитела против CD44 (Abcam, ab157107) в течение ночи при 4ºC. Затем к смеси белок-антитело добавляли промытые шарики протеина G (50 мкл, MagQu, MF-PRG-3000) с последующей инкубацией в течение 5 часов при 4ºC. После промывки белковый комплекс выделяли нагреванием при 95ºC в течение 3 минут в загрузочном буфере. CD44 и OPN были разделены с помощью SDS-PAGE, и иммуноблоты были затем зондированы антителами против CD44 (Abcam ab157107) и против OPN (O17, IBL 18625).

Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК (2 мкг) экстрагировали из тканей и клеточных линий с помощью реагента TRIZOL (Invitrogen), обрабатывали ДНКазой RQ1 (Promega # M6101) и подвергали синтезу кДНК в соответствии с инструкциями производителя. инструкция (Эпицентр RT80125K).Все реакции ПЦР в реальном времени проводили с помощью системы ABI StepOne с использованием FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche). Для ПЦР в реальном времени использовали следующие праймеры: 18S рРНК -F, 5'-TCGGAACTGAGGCCATGA-3 'и 18S рРНК -R, 5'-CCGGTCGGCATCGTTTA-3'. Праймеры для обнаружения изоформ OPN были следующими: 5’-CATCACCTGTGCCATACCA-3 ’(расположенный в экзоне 2) и 5’-GGCTGTCCCAATCAGA-3’ (расположенный в экзоне 6). Праймеры для обнаружения интегринов были следующими: ITGα3 -F, 5’-TGCTCACCCCTCACTCCT-3 ’; ITGα3 -R, 5’- GGCAGTCCCAGCTTCTCT-3 ’; ITGα4 -F, 5’-GCT CGGGAGCAGTAATGAA-3 ’; ITGα4 -R, 5’- ATCTGCA CGGCCATTGTA-3 ’; ITGα5 -F, 5’-CCCTGCCGCTCAG ATTT-3 ’; ITGα5 -R, 5’-CTGGCCTGGCGAGTCT-3 ’; ITGαv -F, 5’-CAAAGCAAACACCACCCA-3 ’; ITGα9 -F, 5’-GTGATGCCGGTGGGATA-3 ’; ITGα9 -R, 5’-CCGGGAGGAAGATGGA-3 ’; ITGαv -R, 5’-GGG GCACAGGCCAA-3 ’; ITGβ1 -F, 5’-CGTAGCAAAG GAACAGCAGA-3 ’; ITGβ1 -R, 5’- AGTCCGAAGTA ATCCTCCTCA-3 ’; ITGβ3 -F, 5’-GGCCCCTCA GCGACA-3 ’; ITGβ3 -R, 5’-AATGCCCCGAAGCCA-3 ’; ITGβ5 -F, 5’- TGGCTGGCGAAAGGAT-3 ’; ITGβ5 -R, 5’- GCAAGGCAAGGGATGGAT-3 ’.Праймеры для обнаружения вариантов CD44 были следующими: CD44 -F, 5’-TCTACCCCAGCAACCCTACT-3 ’; CD44 -R, 5’-CCACCTTCTTGACTCCCATGT-3 ’; CD44v6 -F, 5’-TCC AGGCAACTCCTAGTAGTACA-3 ’; CD44v6 -R, 5’-GGT GTGAGATTGGGTTGAA-3 ’; CD44v8 -F, 5’-CGC TTCAGCCTACTGCAA-3 ’; CD44v8 -R, 5’-GGGT CTCTTCTTCCACCTGT-3 ’.

Анализ роста клеток

Клетки культивировали до 70% конфлюэнтности. После отсоединения 3 × 10 4 клеток высевали на 12-луночные планшеты и культивировали в RPMI-1640 (для CL1-5) или DMEM (для A549), содержащей 10% FBS с CM или очищенным OPN-a или без него.После 16 ч инкубации клетки собирали и подсчитывали жизнеспособные клетки; этот момент времени был обозначен как 0 ч. После дополнительных 24 ч инкубации клетки собирали и подсчитывали жизнеспособные клетки; этот момент времени был обозначен как 24 часа. Для скрининга ингибиторов пути инокулировали 3 × 10 4 клеток и инкубировали в течение 16 часов. Затем клетки либо собирали перед обработкой (обозначено как 0 часов), либо обрабатывали различными ингибиторами в течение 48 часов (обозначено как 48 часов), и подсчитывали жизнеспособные клетки.Кратное изменение количества клеток рассчитывали путем деления количества жизнеспособных клеток через 24 часа (или 48 часов) на количество клеток через 0 часов. Относительное кратное изменение количества клеток рассчитывали путем деления каждого кратного изменения в обрабатываемых клетках на кратное изменение в контрольных клетках.

Анализ формирования фокуса

Для анализа формирования фокуса 200 клеток высевали на чашку диаметром 3,5 см. После инкубации в течение 7–9 дней колонии фиксировали 100% ледяным метанолом в течение 30 минут с последующим окрашиванием 20% Гимза в течение 30 минут.

Очистка OPN-a из CM / OPN-a

Для очистки эктопически экспрессированного OPN-a стабильный клон CL1-5 / OPN-a-Myc-His или клетки CL1-5 / VC выращивали до 100% слияния. в посуде диаметром 10 см. Среду заменяли 4 мл бессывороточной среды RPMI с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 24 часов. Было собрано около 120 мл КМ и сконцентрировано с помощью центробежного концентратора Vivaspin® 15R примерно до 5 мл с последующей инкубацией с равным объемом агарозных гранул Ni-NTA (QIAGEN) при 4ºC в течение 2 часов.После промывания промывочным буфером (50 мМ Na 2 HPO 4 , 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,05% Твин 20, pH 8,0) OPN-a элюировали элюирующим буфером (50 мМ Na 2 HPO 4 , 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, 0,05% Твин 20, pH 8,0). Для удаления имидазола элюент подвергали диализу против 1xPBS. Концентрацию очищенного OPN-a определяли с использованием набора для анализа белка Брэдфорда (Bio-Rad).

Приготовление кондиционированной среды

Кондиционированную среду (CM) получали из клеток, временно или стабильно трансфицированных различными вариантами сплайсинга OPN.Все клетки выращивали до полного слияния в среде для выращивания с 10% FBS, которую затем заменяли 2 мл свежей среды с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 24 часов в чашках диаметром 3,5 см. После удаления клеточного дебриса центрифугированием CM смешивали с равными объемами свежей среды, содержащей 10% FBS, для анализов клеточных культур.

Статистический анализ

Все анализы роста, за исключением эксперимента по анализу ингибитора пути, повторяли независимо, по крайней мере, раз с тремя повторностями в каждом эксперименте.Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение. Для статистического анализа использовали программное обеспечение GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния, http://www.graphpad.com). Статистическая значимость оценивалась с помощью тестов Стьюдента t и выражалась следующим образом: * , p <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001 .; ### , p <0,001; +++ , p <0,001.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Dr.Цзюнн-Лян Ко, д-р Вэнь-Цзюнь Ву и д-р Хуэй Ли за их экспертные консультации и советы, а Цзинъяо Чан за финансовую поддержку этой работы.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ПОДДЕРЖКА ГРАНТА

Эта работа была поддержана грантом Национального научного совета NSC 102-2320-B-040-010-MY2 (Тайвань, Р.О.К.) Цзинхуа Цай Чангу.

СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

1. Senger DR, Wirth DF и Hynes RO. Трансформированные клетки млекопитающих секретируют специфические белки и фосфопротеины.Клетка. 1979; 16: 885-893.

2. О’Реган А. и Берман Дж. С.. Остеопонтин: ключевой цитокин при клеточно-опосредованном и гранулематозном воспалении. Международный журнал экспериментальной патологии. 2000; 81: 373-390.

3. Йокосаки Ю., Танака К., Хигашикава Ф., Ямасита К. и Эбошида А. Четкие структурные требования для связывания интегринов alphavbeta6, alphavbeta3, alphavbeta5, alpha5beta1 и alpha9beta1 с остеопонтином. Matrix Biol. 2005; 24: 418-427.

4. Вебер Г.Ф., Ашкар С., Глимчер М.Дж. и Кантор Х.Рецепторно-лигандное взаимодействие между CD44 и остеопонтином (Эта-1). Science (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, 1996; 271: 509-512.

5. Катагири Ю.Ю., Слиман Дж., Фуджи Х., Херрлих П., Хотта Х., Танака К., Чикума С., Ягита Х., Окумура К., Мураками М., Сайки. I, Chambers AF и Uede T. Варианты CD44, но не CD44, взаимодействуют с бета1-содержащими интегринами, позволяя клеткам связываться с остеопонтином независимо от аргинин-глицин-аспарагиновой кислоты, тем самым стимулируя подвижность клеток и хемотаксис. Cancer research. 1999; 59: 219 -226.

6. Cui R, Takahashi F, Ohashi R, Gu T, Yoshioka M, Nishio K, Ohe Y, Tominaga S, Takagi Y, Sasaki S, Fukuchi Y и Takahashi K. Отмена взаимодействия между остеопонтином и интегрином alphavbeta3 снижает опухолевый рост клеток рака легких человека у мышей. Рак легких. 2007; 57: 302-310.

7. Инь М., Сойккели Дж., Яхкола Т., Виролайнен С., Саксела О. и Хольтта Е. Остеопонтин способствует инвазивному росту клеток меланомы, активируя интегрин alphavbeta3 и подавляя тетраспанин CD9.Американский журнал патологии. 2014; 184: 842-858.

8. Сангалетти С., Триподо С., Сандри С., Торселли I, Витали С., Ратти С., Ботти Л., Бурокки А., Поркаси Р., Томиротти А., Коломбо М. П. и Чиодони С. Остеопонтин формирует иммуносупрессию в метастатической нише. Исследования рака. 2014; 74: 4706-4719.

9. Бойеринас Б., Зафрир М., Есилканал А.Е., Прайс Т.Т., Хиджек Е.М. и Сипкинс Д.А. Адгезия к остеопонтину в нише костного мозга регулирует состояние покоя лимфобластных лейкозных клеток. Кровь.2013; 121: 4821-4831.

10. Кария Ю., Канно М., Мацумото-Морита К., Конно М., Ямагути Ю. и Хашимото Ю. О-гликозилирование остеопонтина способствует его фосфорилированию и свойствам клеточной адгезии. Биохимический журнал. 2014; 463: 93-102.

11. Так А.Б., О’Мэлли Ф.П., Сингхал Х., Тонкин К.С., Харрис Дж.Ф., Баутиста Д. и Чемберс А.Ф. Экспрессия остеопонтина и р53 связана с прогрессированием опухоли в случае синхронных двусторонних инвазивных карцином молочной железы. Архивы патологии и лабораторной медицины.1997; 121: 578-584.

12. Ue T., Yokozaki H, Kitadai Y, Yamamoto S, Yasui W., Ishikawa T. и Tahara E. Совместная экспрессия остеопонтина и CD44v9 при раке желудка. Международный журнал рака. 1998; 79: 127-132.

13. Вай П.Й. и Куо ПК. Остеопонтин: регуляция метастазирования опухоли. Отзывы о метастазах рака. 2008; 27: 103-118.

14. Шиджубо Н., Уэде Т., Кон С., Маэда М., Сегава Т., Имада А., Хирасава М. и Абэ С. Фактор роста эндотелия сосудов и остеопонтин при аденокарциноме легких I стадии.Американский журнал респираторной медицины и реанимации. 1999; 160: 1269-1273.

15. Чемберс А.Ф., Уилсон С.М., Керквлит Н., О’Мэлли Ф.П., Харрис Дж. Ф. и Кассон А.Г. Экспрессия остеопонтина при раке легких. Рак легкого (Амстердам, Нидерланды). 1996; 15: 311-323.

16. Так А.Б., О’Мэлли Ф.П., Сингхал Х., Харрис Дж.Ф., Тонкин К.С., Керквлит Н., Саад З., Дойг Г.С. и Чемберс А.Ф. Экспрессия остеопонтина в группе больных раком молочной железы без лимфоузлов. Международный журнал рака.1998; 79: 502-508.

17. Агравал Д., Чен Т., Ирби Р., Квакенбуш Дж., Чемберс А.Ф., Сабо М., Кантор А., Коппола Д. и Йитман Т.Дж. Остеопонтин идентифицирован как ведущий маркер прогрессирования рака толстой кишки с использованием профилей экспрессии объединенного образца. Журнал Национального института рака. 2002; 94: 513-521.

18. Гото М., Сакамото М., Канетака К., Чуума М. и Хирохаши С. Сверхэкспрессия остеопонтина при гепатоцеллюлярной карциноме. Патология международная. 2002; 52: 19-24.

19. Thalmann GN, Sikes RA, Devoll RE, Kiefer JA, Markwalder R, Klima I., Farach-Carson CM, Studer UE и Chung LW.Остеопонтин: возможная роль в прогрессировании рака простаты. Clin Cancer Res. 1999; 5: 2271-2277.

20. Сайто Й., Курацу Дж., Такешима Х., Ямамото С. и Ушио Ю. Экспрессия остеопонтина в глиоме человека. Его корреляция со злокачественным новообразованием. Лабораторное исследование; журнал технических методов и патологии. 1995; 72: 55-63.

21. Хе Б., Мирза М. и Вебер Г.Ф. Вариант сплайсинга остеопонтина индуцирует независимость закрепления в клетках рака груди человека. Онкоген. 2006; 25: 2192-2202.

22. Чае С., Джун Хо, Ли Э.Г., Ян С.Дж., Ли Д.К., Юнг Дж.К., Пак К.С., Йом Йи и Ким К.В. Варианты сплайсинга остеопонтина по-разному модулируют миграционную активность клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы. Международный журнал онкологии. 2009; 35: 1409-1416.

23. Tilli TM, Mello KD, Ferreira LB, Matos AR, Accioly MT, Faria PA, Bellahcene A, Castronovo V и Gimba ER. Изоформы сплайсинга как остеопонтина-с, так и остеопонтина-b играют про-туморогенные роли в клетках рака простаты. Простата.2012; 72: 1688-1699.

24. Goparaju CM, Pass HI, Blasberg JD, Hirsch N and Donington JS. Функциональная гетерогенность изоформ остеопонтина при немелкоклеточном раке легкого. J Thorac Oncol. 5: 1516-1523.

25. Чуанг С.Й., Чанг Х., Линь П., Сун С.Дж., Чен П.Х., Линь Й.Ю., Шеу Г.Т., Ко Дж.Л., Сюй С.Л. и Чанг Дж.Т. Повышающая регуляция экспрессии остеопонтина арилуглеводородным рецептором через лиганд-зависимые и лиганд-независимые пути при раке легких. Ген. 2012; 492: 262-269.

26.Bourguignon LY, Xia W. и Wong G. Опосредованное гиалуронаном взаимодействие CD44 с p300 и SIRT1 регулирует передачу сигналов бета-катенина и специфическую транскрипционную активность NFkappaB, приводящую к экспрессии генов MDR1 и Bcl-xL и химиорезистентности в опухолевых клетках молочной железы. Журнал биологической химии. 2009; 284: 2657-2671.

27. Чен Й.Дж., Вэй Й.и., Чен Х.Т., Фонг Ю.С., Хсу СиДжей, Цай Ч., Хсу Х.С., Лю Ш. и Тан Ч. Остеопонтин увеличивает миграцию и активацию MMP-9 через интегрин alphavbeta3, FAK, ERK и NF-kappaB-зависимый путь в клетках хондросаркомы человека.Журнал клеточной физиологии. 2009; 221: 98-108.

28. Фонг Ю.К., Лю С.К., Хуан С.Ю., Ли Т.М., Сюй С.Ф., Као С.Т., Цай Ф.Дж., Чен В.С., Чен С.Й. и Тан С. Остеопонтин увеличивает миграцию клеток рака легких за счет активации интегрина alphavbeta3 / FAK / Akt и NF-kappaB-зависимого пути. Рак легкого (Амстердам, Нидерланды). 2009; 64: 263-270.

29. Dai J, Peng L, Fan K, Wang H, Wei R, Ji G, Cai J, Lu B, Li B, Zhang D, Kang Y, Tan M, Qian W и Guo Y. Остеопонтин индуцирует ангиогенез через активация PI3K / AKT и ERK1 / 2 в эндотелиальных клетках.Онкоген. 2009; 28: 3412-3422.

30. Сенгер Д.Р., Ледбеттер С.Р., Клаффи К.П., Пападопулос-Серджиу А., Перуцци К.А. и Детмар М. Стимуляция миграции эндотелиальных клеток с помощью фактора проницаемости сосудов / фактора роста эндотелия сосудов посредством кооперативных механизмов, включающих интегрин alphavbeta3, остеопонтин и тромбин . Американский журнал патологии. 1996; 149: 293-305.

31. Терамото Х., Кастеллоне, М.Д., Малек Р.Л., Летвин Н., Фрэнк Б., Гуткинд Дж. С. и Ли Н.Х. Аутокринная активация пути остеопонтин-CD44-Rac усиливает инвазию и трансформацию H-RasV12.Онкоген. 2005; 24: 489-501.

32. Айлан С., Лонг П., Дженнер П. и Роуз С. Экспрессия интегрина и рецепторов CD44, распознающих остеопонтин, в нормальной черной субстанции крыс и с поражением ЛПС. Eur J Neurosci. 2013; 38: 2468-2476.

33. Dalal S, Zha Q, Daniels CR, Steagall RJ, Joyner WL, Gadeau AP, Singh M и Singh K. Остеопонтин стимулирует апоптоз в сердечных миоцитах взрослых посредством вовлечения рецепторов CD44, пути гибели митохондрий и стресса эндоплазматического ретикулума .Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2014; 306: h2182-1191.

34. Ван К.Х. и Денхардт Д.Т. Остеопонтин: роль в иммунной регуляции и стрессовых ответах. Обзоры цитокинов и факторов роста. 2008; 19: 333-345.

35. Гао Ц., Го Х., Дауни Л., Маррокин Ц., Вэй Дж. И Куо П.С.. Остеопонтин-зависимая экспрессия CD44v6 и клеточная адгезия в клетках HepG2. Канцерогенез. 2003; 24: 1871-1878.

36. Ли Дж. Л., Ван М. Дж., Судхир П. Р., Чен Г. Д., Чи К. В. и Чен Дж. Й. Остеопонтин способствует активации интегрина посредством механизмов «снаружи внутрь» и «наизнанку»: взаимодействие OPN-CD44V увеличивает выживаемость в раковых клетках желудочно-кишечного тракта.Исследования рака. 2007; 67: 2089-2097.

37. Кроуфорд Х.С., Матрисиан Л.М. и Лиау Л. Различная роль остеопонтина в защитной активности хозяина и выживаемости опухоли во время прогрессирования плоскоклеточной карциномы in vivo. Исследования рака. 1998; 58: 5206-5215.

38. Wai PY, Guo L, Gao C, Mi Z, Guo H и Kuo PC. Остеопонтин подавляет синтез оксида азота макрофагами, усиливая пролиферацию опухоли. Операция. 2006; 140: 132-140.

Уровни интегрина β3 и CD44 определяют влияние варианта сплайсинга OPN-a на рост клеток рака легких

Oncotarget.2016 Aug 23; 7 (34): 55572–55584.

, # 1 , # 1 , 1 , 2 , 2 , 2 , 2, 3 , 4 и 1, 2 , 5

Shih-Jung Sun

1 Институт медицины, Медицинский университет Чжуншань, Тайчжун, Тайвань, ROC

Chun-Chi Wu

1 Институт медицины, Медицинский университет Чун Шань, Тайчжун , Тайвань, ROC

Gwo-Tarng Sheu

1 Институт медицины, Медицинский университет Чжун-Шань, Тайчжун, Тайвань, ROC

Hui-Yi Chang

2 Институт медицинской и молекулярной токсикологии, Chung Shan Medical Университет, Тайчжун, Тайвань, ROC

Mei-Yu Chen

2 Институт медицинской и молекулярной токсикологии, Медицинский университет Чжуншань, Тайчжун, Тайвань, ROC

Yu-Ying Lin

2 Institute of Me клиническая и молекулярная токсикология, Медицинский университет Чжун Шань, Тайчжун, Тайвань, ROC

Cheng-Yen Chuang

2 Институт медицинской и молекулярной токсикологии, Медицинский университет Чжун Шань, Тайчжун, Тайвань, ROC

3 Отделение Торакальная хирургия, Главный госпиталь для ветеранов Тайчжун, Тайчжун, Тайвань, ROC

Shih-Lan Hsu

4 Департамент образования и исследований, Главный госпиталь для ветеранов Тайчжун, Тайчжун, Тайвань, ROC

Jinghua Tsai Chang

Институт медицины, Медицинский университет Чжун-Шань, Тайчжун, Тайвань, ROC

2 Институт медицинской и молекулярной токсикологии, Медицинский университет Чунг-Шань, Тайчжун, Тайвань, ROC

5 Кафедра грудной медицины, Медицинский университет Чжун-Шань Больница, Тайчжун, Тайвань, ROC

1 Институт медицины, Медицинский университет Чжуншань, Тайчжун, Тайвань, RO C

2 Институт медицинской и молекулярной токсикологии, Медицинский университет Чжуншань, Тайчжун, Тайвань, Китайская республика

3 Отделение торакальной хирургии, Общая больница для ветеранов Тайчжун, Тайчжун, Тайвань, ROC

4 Отделение Образование и исследования, Главный госпиталь для ветеранов Тайчжун, Тайчжун, Тайвань, ROC

5 Отделение грудной медицины, Больница Медицинского университета Чжуншань, Тайчжун, Тайвань, ROC

# Внесено поровну.

Поступила 25.11.2015; Принято 7 июня 2016 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Остеопонтин (OPN), фосфорилированный гликопротеин, часто сверхэкспрессируется при раке. Среди трех изоформ OPN OPN-a наиболее высоко экспрессируется в клеточных линиях рака легких и опухолях легких.Сверхэкспрессия OPN-a значительно снижает рост клеток аденокарциномы легких CL1-5, но не влияет на рост клеток аденокарциномы легкого A549. Изучение экспрессии интегринов и CD44, которые являются возможными рецепторами OPN-a, показало, что различия в уровнях интегрина β3 могут объяснить это несоответствие между клетками CL1-5 и A549. Когда интегрин β3 эктопически экспрессировался в клетках A549, OPN-a ингибировал их рост, тогда как OPN-a увеличивал рост клеток после нокдауна интегрина β3 в клетках CL1-5.Это индуцированное OPN-a увеличение роста, по-видимому, является результатом активации пути CD44 / NFκB. Наши результаты показали, что OPN-a ингибирует рост клеток с высокими уровнями интегрина β3 и увеличивает рост за счет активации пути CD44 / NFκB в клетках с низкими уровнями интегрина β3. Таким образом, OPN-a, интегрин β3 и CD44 взаимодействуют, влияя на рост клеток рака легких, и это исследование может помочь в разработке стратегий лечения рака с участием этих молекул.

Ключевые слова: OPN-a, Integrin beta3, CD44, NF-kB

ВВЕДЕНИЕ

Остеопонтин (OPN) представляет собой многофункциональный фосфорилированный гликопротеин и индуцибельный маркер, секретируемый трансформированными злокачественными эпителиальными клетками [1].Он экспрессируется в широком спектре клеток и регулирует многие биологические функции, включая иммунные ответы, ремоделирование тканей и васкуляризацию, посредством своего воздействия на два типа молекул клеточной адгезии: интегрины [2, 3] и CD44 [4, 5]. OPN также участвует в опухолевой пролиферации [6, 7], выживании [8], адгезии [9, 10], миграции [11, 12], инвазии и ангиогенезе [13]. Повышенная экспрессия OPN связана со снижением прогрессирования и метастазирования в рак легких [14, 15], груди [11, 16], толстой кишки [17], печени [18], желудка [12] и простаты [19].

Было идентифицировано несколько изоформ транскриптов OPN, включая OPN-a (полноразмерная форма), OPN-b (без экзона 5) и OPN-c (без экзона 4) (рисунок) [20]. Многочисленные исследования, посвященные роли этих изоформ в онкогенезе, дали противоречивые результаты. При раке молочной железы OPN-c более эффективен в усилении независимого от закрепления роста, чем OPN-a [21]. В клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы OPN-a и -b, но не OPN-c, индуцируют миграцию клеток в клетках SK-Hep1 с высокой миграционной способностью.Напротив, OPN-c, но не OPN-a, подавляет миграцию в клетках Hep3B. OPN-c также способствует образованию адгезионных очагов в клетках Hep3B [22]. В клетках рака предстательной железы PC-3 избыточная экспрессия OPN-b и OPN-c способствует онкогенезу [23]. В клеточных линиях немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) OPN-a и OPN-b усиливают, в то время как OPN-c подавляет инвазию клеток. Более того, в то время как OPN-a усиливает, а OPN-c подавляет образование колоний, OPN-b имеет противоречивые эффекты [24].

Экспрессия OPN в клеточных линиях

A. Принципиальная схема изоформ OPN. OPN-a - это полноразмерная изоформа (314 а.о.), OPN-b не имеет экзона 5 (300 а.о.), а OPN-c отсутствует экзон 4 (287 а.о.). B. Двадцать мкг общего белка подвергали Вестерн-блоттингу. Экспрессия OPN была низкой в ​​нескольких высокоинвазивных клеточных линиях, включая CL1-5, CL1-5-F4, h2299 и A549. C. Экспрессия изоформ OPN в различных клеточных линиях рака легкого и образцах аденокарциномы легкого (AD). Контрольные полосы представляли собой смешанные изоформы, амплифицированные из конструкций OPN-a, OPN-b и OPN-c с помощью ПЦР.

Мы наблюдали, что 65% образцов НМРЛ экспрессируют высокие уровни белка OPN [25]. Преобладающей формой OPN, экспрессируемой в клеточных линиях рака легких и опухолях легких, является OPN-a. В отсутствие интегрина β3 (ITGβ3) OPN-a усиливает рост клеток посредством пути CD44 / NFκB. Когда уровни OPN-a низкие, ITGβ3 необходим для роста клеток рака легких CL1-5. Однако OPN-a ингибирует рост клеток рака легких в присутствии высоких уровней ITGβ3. Целью этого исследования было изучить влияние ITGβ3 и CD44, двух важных молекул, усиливающих рост, в клетках рака легких, на регуляторную роль OPN-a в росте клеток рака легкого.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сплайсинг OPN влияет на рост клеток рака легких

Сверхэкспрессия OPN участвует в росте опухоли и инвазии при различных раковых заболеваниях, включая рак легких. Однако ряд высокоинвазивных клеточных линий рака легких, таких как A549, h2299 и CL1-5, экспрессировали низкие уровни белка OPN (рисунок). Среди трех изоформ OPN OPN-a была изоформой с наиболее высокой экспрессией в клеточных линиях и опухолях рака легких (рисунок).

вариантов сплайсинга OPN-a, OPN-b и OPN-c были клонированы и временно трансфицированы в клетки CL1-5 и A549.Эти эктопически экспрессируемые белки OPN также секретировались в культуральную среду (рисунок). Чтобы определить влияние различных вариантов сплайсинга OPN на рост клеток, мы обрабатывали клетки CL1-5 кондиционированной средой (CM) из других клеток CL1-5, временно трансфицированных различными изоформами OPN. Неожиданно, клетки CL1-5, обработанные CM / OPN-a, имели более медленную скорость роста, чем клетки, обработанные средой, собранной из пустых векторных контролей (VC). Обработка CM, содержащая OPN-b или OPN-c, имела незначительный эффект или не влияла на рост клеток CL1-5 (рисунок).Мы также провели такой же эксперимент на клетках A549. Неожиданно A549 CM / OPN-a не ингибировал рост клеток A549 (рисунок). Возможно, что сверхэкспрессия OPN-a индуцирует секрецию различных молекул в клетках CL1-5 и A549, вызывая разные реакции роста клеток. Альтернативно, это несоответствие в действии OPN-a на рост клеток CL1-5 и A549 можно объяснить различиями в уровнях экспрессии рецептора или последующего эффектора. Таким образом, клетки CL1-5 и A549 обрабатывали CM, собранным из клеток CL1-5 (рисунок) или A549 (рисунок), экспрессирующих различные варианты сплайсинга OPN.CM / OPN-a из клеток CL1-5 или A549 подавлял рост клеток CL1-5, но не A549.

Влияние OPN-a на рост клеток

A. Сверхэкспрессированные варианты сплайсинга OPN секретировались в среду (CM) на аналогичных уровнях. VC представляет клетки, трансфицированные пустым вектором. B. CM из клеток CL1-5, временно трансфицированных различными вариантами сплайсинга OPN или VC, использовали для лечения других клеток CL1-5. CM / OPN-a сильно ингибировал рост клеток CL1-5, в то время как CM, содержащий OPN-b или OPN-c, оказывал незначительное влияние или не имел никакого эффекта.Кратковременные изменения количества клеток определяли путем деления количества клеток через 24 часа на количество клеток через 0 часов. Относительное кратное изменение количества клеток рассчитывали путем деления каждого кратного изменения в клетках, обработанных CM / OPN, на кратное изменение в клетках CM / VC. * , p <0,05. C. CM, собранные из клеток A549, временно трансфицированных различными вариантами сплайсинга OPN, или VC, использовали для обработки других клеток A549. В отличие от клеток CL1-5, CM, содержащие OPN-a, OPN-b или OPN-c, не подавляли рост клеток A549. D. CM, содержащий различные варианты сплайсинга OPN, собирали из клеток CL1-5 и использовали для обработки клеток CL1-5 и A549. CM / OPN-a из клеток CL1-5 ингибировал рост клеток CL1-5, но не A549. *** , p <0,001. E. CM, содержащий различные варианты сплайсинга OPN, собирали из клеток A549 и использовали для обработки клеток CL1-5 и A549. CM / OPN-a из клеток A549 ингибировал рост клеток CL1-5, но не клеток A549. ** , p <0,01. F. Экспрессия экзогенного OPN-a в стабильных клонах CL1-5. Все стабильные клоны CL1-5 / OPN-a показали низкую способность к формированию фокуса по сравнению с векторными контролями (VC). G. Стабильные клоны CL1-5, сверхэкспрессирующие OPN-a, показали более медленные темпы роста по сравнению с VC. * , p <0,05.

Затем мы провели скрининг клеток CL1-5, стабильно экспрессирующих OPN-a с помощью G418 (рисунок), и выполнили анализы формирования фокуса и анализ роста клеток на OPN-стабильных клонах. В соответствии с результатами лечения CM, клетки CL1-5, стабильно экспрессирующие OPN-a, генерировали меньше и меньшие очаги по сравнению с клетками VC (рисунок).Кроме того, темпы роста были ниже у клеток CL1-5, эктопически экспрессирующих OPN-a (рисунок).

Чтобы дополнительно подтвердить, что OPN-a непосредственно подавляет рост клеток CL1-5, мы использовали Ni-NTA для очистки OPN-a от CM (рисунок). Как показано на фигуре, очищенный OPN-a эффективно подавлял рост клеток CL1-5, но не A549. В совокупности эти результаты продемонстрировали, что OPN-a, но не OPN-b или OPN-c, обладает способностью ингибировать рост клеток. Однако OPN-a не подавлял рост всех клеток рака легких.

Очищенный OPN-a подавляет рост CL1-5, но не A549, клеток

A.Слитый белок OPN-a-Myc-His очищали с помощью Ni-NTA агарозы. Левая панель: загружали 10 мкг очищенного OPN-a. Правая панель, вестерн-блоттинг очищенного OPN-a (3 мкг) и CM / OPN-a (50 мкл), детектированного с помощью антитела против OPN (O17). B. Очищенный OPN-a снижает рост раковых клеток CL1-5. VC представляет собой обработку материала из контрольного стабильного клона CL1-5 / Vector с использованием того же процесса очистки. C. Очищенный OPN-a не влиял на рост клеток A549.

ITGβ3 участвует в опосредованном OPN-a ингибировании роста

Секретируемый OPN может связываться с различными интегринами и CD44 для активации сигнальных путей.Таким образом, мы провели ПЦР в реальном времени для обнаружения различий в экспрессии интегринов и CD44 в клетках CL1-5 и A549. Как показано на фигуре, большинство детектируемых интегринов и вариантов CD44 были более высоко экспрессированы в клетках A549; однако экспрессия интегринов α4, α5 и β3 была выше в клетках CL1-5. Среди этих трех интегринов разница в экспрессии β3 была наибольшей между двумя типами клеток. Чтобы определить, играет ли ITGβ3 роль в индуцированном OPN-a ингибировании роста клеток CL1-5, мы снижали экспрессию ITGβ3 в стабильных клонах CL1-5 / OPN-a и CL1-5 / VC и отслеживали скорость их роста.Нокдаун экспрессии ITGβ3 усиливал рост в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a (рисунок, сплошные линии). Точно так же родительские клетки CL1-5 с пониженной экспрессией ITGβ3, которые были обработаны очищенным OPN-a, росли быстрее, чем родительские клетки CL1-5 с нормальной экспрессией ITGβ3 после такой же обработки (рисунок). OPN-a также ингибировал рост клеток A549, сверхэкспрессирующих ITGβ3 (рисунок). Кроме того, индуцированное OPN-a ингибирование роста также наблюдалось в клетках h560 и h2299, сверхэкспрессирующих ITGβ3 (рисунок). Эти результаты продемонстрировали, что ITGβ3 необходим для ингибирования роста, индуцированного OPN-a.В отсутствие OPN-a ITGβ3 был необходим для роста клеток CL1-5 (фигуры). Эффективность si-ITGβ3 в клетках CL1-5 и эктопическая экспрессия ITGβ3 показаны на фиг.

ITGβ3 необходим для ингибирования роста, индуцированного OPN-a.

A. Экспрессию различных мРНК интегрина и изоформы CD44 оценивали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Уровни экспрессии интегрина α4, α5 и β3 были ниже в клетках A549, чем в клетках CL1-5. Разница в экспрессии ITGβ3 между клетками CL1-5 и A549 была наиболее значительной. * , p <0,05; ** , p <0,01, *** , p <0,001. B. Кривые роста для стабильно экспрессирующих OPN-a клеток CL1-5, обработанных si-ITGβ3 или si-NC. Стабильный клон OPN-a (OPN-a / si-NC) рос медленнее, чем клетки VC / si-NC. Нокдаун ITGβ3 обращал индуцированное OPN-a ингибирование роста в клетках CL1-5 (OPN-a / si-ITGβ3). ITGβ3 также увеличивал рост клеток CL1-5 (сравнение между VC / si-NC и VC / si-ITGβ3). С. Эффективность si-ITGβ3 в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a измеряли с помощью ПЦР RT в реальном времени в клетках (B). ** , p <0,01, *** , p <0,001. D. Клетки CL1-5, трансфицированные si-ITGβ3 или si-NC, обрабатывали очищенным OPN-a. Подобно нокдауну ITGβ3 в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a (B), нокдаун ITGβ3 в клетках CL1-5 обращал ингибирование роста, индуцированное OPN-a. * , p <0,05. E. Клетки A549, экзогенно экспрессирующие ITGβ3, обрабатывали очищенным OPN-a.Сверхэкспрессия ITGβ3 значительно снижает рост клеток A549, что позволяет предположить, что ITGβ3 необходим для ингибирования роста, индуцированного OPN-a. ** , p <0,01. F. Экспрессия белка ITGβ3 в клетках CL1-5 / si-ITGβ3 и A549 / ITGβ3 в (D и E). G. Очищенный OPN-a ингибировал рост клеток h560 / ITGβ3 и h2299 / ITGβ3, но не влиял на рост клеток h560 и h2299.

В отсутствие ITGβ3 OPN-a индуцирует рост клеток по пути CD44 / NFkB

В отсутствие ITGβ3 OPN-a усиливает рост клеток CL1-5 (фиг. &).Поскольку OPN связывается с различными интегринами и CD44, возможно, что OPN-a может связываться с другим рецептором для усиления роста в отсутствие ITGβ3. Таким образом, мы обрабатывали стабильные клоны CL1-5 / OPN-a и CL1-5 / VC, трансфицированные si-ITGβ3, различными ингибиторами сигнального пути для скрининга путей, участвующих в OPN-a-индуцированном росте в отсутствие ITGβ3. Ингибирование активности NFκB с помощью Bay-11-7082 блокировало рост, индуцированный OPN-a (рисунок). Чтобы подтвердить этот результат, мы обрабатывали стабильные клоны CL1-5 / OPN-a и CL1-5 / VC, временно трансфицированные si-ITGβ3 или si-NC с помощью Bay-11-7082, и измеряли рост клеток.Как показано на фигуре, нокдаун ITGβ3 в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a усиливал рост клеток (дорожки 5 и 7). Однако обработка 10 нМ Bay-11-7082 ингибировала OPN-a-индуцированный рост клеток CL1-5 / si-ITGβ3 (рисунок, дорожки 7 и 8), но не подавляла рост клеток CL1-5 / VC независимо от Экспрессия ITGβ3 (рисунок, дорожки 1 и 2; дорожки 3 и 4). Нокдаун как ITGβ3, так и субъединицы p65 NFκB блокировал OPN-a-индуцированный рост в клетках CL1-5 (фиг., Дорожки 5 и 6) по сравнению с клетками CL1-5 с выключением только ITGβ3 (дорожки 3 и 4).Эффективность si-ITGβ3 и si-p65 показана на фиг.

OPN-a индуцирует рост клеток после нокдауна ITGβ3 через путь CD44 / NFκB

A. Скрининг путей, участвующих в ингибировании роста, индуцированном OPN-a. Стабильно экспрессирующие OPN-a или пустые клетки вектора CL1-5 временно трансфицировали si-ITGβ3 и обрабатывали различными ингибиторами пути. Кратковременные изменения количества клеток определяли путем деления количества клеток через 48 часов на количество клеток через 0 часов. Относительное кратное изменение количества клеток рассчитывали путем деления каждого кратного изменения в клетках OPN / si-ITGβ3 на кратное изменение в клетках VC / si-ITGβ3 для каждой обработки ингибитором.Ингибитор NFκB Bay11-7082 в значительной степени подавлял рост клеток CL1-5 / OPN-a с индуцированным РНКи нокдауном ITGβ3. PD98059: ингибитор MAPK; SP600125: ингибитор JNK; U0126: ингибитор МЕКК; LY294002: ингибитор PI3K. B. Участие NFκB в ингибировании роста, индуцированном OPN-a. Стабильные клоны CL1-5 / OPN-a и CL1-5 / VC трансфицировали si-ITGβ3 или si-NC и обрабатывали 10 нМ Bay11-7082 или без него в течение 48 часов. Эктопическая экспрессия OPN-a снижает рост клеток (дорожки 1 и 5). Нокдаун ITGβ3 не только блокировал индуцированное OPN-a ингибирование роста, но также увеличивал рост клеток CL1-5 / OPN-a (дорожки 5 и 7).Обработка Bay11-7082 отменила это увеличение роста (дорожки 7 и 8). Количество клеток подсчитывали до (0 ч) и после (48 ч) обработки для расчета кратного изменения количества клеток. *** , p <0,001; ### , p <0,001; +++ , p <0,001. C. Участие p65 в ингибировании роста, индуцированном OPN-a. Клетки CL1-5 обрабатывали si-ITGβ3, si-p65 или si-ITGβ3 / si-p65 и инкубировали с / без 0.5 мкг / мл очищенного OPN-a в течение 24 часов. Очищенный OPN-a ингибировал рост клеток CL1-5 / si-NC (дорожки 1 и 2). После нокдауна ITGβ3 OPN-a увеличивал, а не ингибировал рост клеток (дорожки 1 и 2 и дорожки 3 и 4). Индуцированный siRNA нокдаун как ITGβ3, так и p65 устраняет это увеличение роста (дорожки 3 и 4 и 5 и 6), указывая на то, что NFκB необходим для OPN-a-индуцированного увеличения роста клеток CL1-5 / si-ITGβ3. Кратное изменение количества клеток рассчитывали с использованием количества клеток, подсчитанных до и после обработки OPN-a * , p <0.05; ** , p <0,01. D. Эффективность si-ITGβ3 (5 пмоль) и si-p65 (50 пмоль), измеренная с помощью вестерн-блоттинга в клетках в (C). E. Эффективность нокдауна si-ITGβ3 (5 пмоль) и si-CD44 (25 пмоль) в клетках CL1-5 в (F), измеренная с помощью ОТ ПЦР в реальном времени. ** , p <0,01; ***, р <0,001; ### , p <0,001. F. Нокдаун CD44 отменял индуцированное OPN-a увеличение роста клеток CL1-5 / si-ITGβ3.Очищенный OPN-a ингибировал рост клеток CL1-5 (дорожки 1 и 2), а нокдаун ITGβ3 усиливал рост клеток (дорожки 3 и 4). Нокдаун CD44 уменьшал это увеличение клеточного роста (дорожки 3 и 4 и дорожки 5 и 6). Кратное изменение количества клеток рассчитывали, используя количество клеток, подсчитанное до и после обработки OPN-a. * , p <0,05; ** , p <0,01; *** , p <0,001. G. Нокдаун ITGβ3 в клетках CL1-5 не только отменял индуцированное OPN-a ингибирование роста, но также увеличивал рост клеток (дорожки 1 и 2 и дорожки 3 и 4).Блокирование CD44 с помощью 0,5 мкг антитела CD44 снижает индуцированное OPN-a увеличение роста клеток CL1-5 / si-ITGβ3 (дорожки 3 и 4 и 5 и 6). IgG является отрицательным контролем для антитела CD44. * , p <0,05.

NFκB является последующим эффектором CD44 [26]. Чтобы определить, способствует ли OPN-a росту путем связывания с CD44 в отсутствие ITGβ3, мы заблокировали экспрессию CD44 в клетках CL1-5 / si-ITGβ3 с помощью РНКи (рисунок) и исследовали влияние OPN-a на рост.Двойной нокдаун ITGβ3 и CD44 ингибировал OPN-a-индуцированный рост клеток (фигура, дорожки 5 и 6) по сравнению с клетками с нокдауном только ITGβ3 (фигура, дорожки 3 и 4), предполагая, что, когда экспрессия ITGβ3 снижается, вместо этого OPN-a связывается с рецептором CD44 и усиливает рост клеток через сигнальный путь NFκB. Этот индуцированный OPN-a рост не происходил после нокдауна как CD44, так и ITGβ3. Чтобы подтвердить эти наблюдения, определяли влияние OPN-a на рост клеток CL1-5 / si-ITGβ3, когда для блокирования функции CD44 использовали антитело против CD44.Анти-CD44 снижал индуцированный OPN-a рост в отсутствие интегрина β3 (рисунок, дорожки 3 и 4 и 5 и 6).

Для исследования влияния OPN-a на экспрессию ITGβ3 на поверхности необработанные клетки CL1-5 и клетки, обработанные 0,5 мкг / мл очищенного OPN-a, иммуноокрашивали анти-ITGβ3. Окрашивание ITGβ3 проявлялось в виде прерывистых сигналов флуоресценции в базальных срезах конфокальных изображений необработанных клеток CL1-5. Однако обработка OPN-a значительно уменьшила пунктурированные и общие сигналы ITGβ3 (рисунок).В соответствии с этим открытием, клетки CL1-5, сверхэкспрессирующие OPN-a, имели более низкие уровни ITGβ3 (рисунок). Кроме того, обработка OPN-a снижала фосфорилирование FAK, нижестоящего эффектора интегрина, предполагая, что обработка OPN-a ослабляла активность ITGβ3 (рисунок). Когда присутствует ITGβ3, OPN-a не влияет на мембранное распределение CD44. Однако после подавления экспрессии ITGβ3 посредством si-РНК обработка OPN-a увеличивала уровни CD44 на мембране (рисунок). Действительно, коиммунопреципитация OPN-a с CD44 была увеличена в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a по сравнению с клоном CL1-5 / VC (рисунок).Эти результаты предполагают, что связывание OPN-a с ITGβ3 снижает уровни ITGβ3 в точках фокусной адгезии или формирование очаговой адгезии. Когда уровни ITGβ3 были снижены, OPN-α связывался, стабилизировал и активировал локализованный на мембране альтернативный рецептор CD44. Таким образом, CD44, ITGβ3 и OPN-a взаимодействуют друг с другом, влияя на рост клеток CL1-5.

Влияние OPN-a на распределение ITGβ3 и CD44 в мембранах клеток CL1-5

A. Клетки CL1-5 обрабатывали OPN-a или без него и иммуноокрашивали антителом против ITGβ3.Окрашивание ITGβ3 проявлялось как пунктированные сигналы (стрелки) в базальном сечении конфокальных изображений в необработанных клетках; Обработка OPN-a значительно уменьшила как пунктурированные, так и общие сигналы. B. Экспрессия ITGβ3 была снижена в клетках, стабильно трансфицированных OPN-a, при Вестерн-блот-анализе. C. Фосфорилирование FAK Y576 было снижено в клетках CL1-5, обработанных 0,5 мкг / мл очищенного OPN-a, по сравнению с необработанными клетками. * , p <0,05. D. Клетки CL1-5, обработанные si-ITGβ3 или без него, инкубировали с / без очищенного OPN-a.Затем клетки иммуноокрашивали анти-CD44. Когда экспрессия ITGβ3 снижалась, очищенный OPN-a увеличивал локализованные на мембране уровни CD44. E. Эффективность si-ITGβ3 в клетках в (D). F. Повышенная коиммунопреципитация OPN-a с CD44 наблюдалась в стабильном клоне CL1-5 / OPN-a по сравнению с клоном CL1-5 / VC.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты этого исследования показали, что OPN-a может как увеличивать, так и подавлять рост раковых клеток в зависимости от экспрессии его рецепторов.Уровни ITGβ3 и CD44 специфически определяют эффекты OPN-a на рост клеток рака легких. Клетки CL1-5 экспрессируют высокие уровни ITGβ3, тогда как клетки A549 экспрессируют низкие уровни ITGβ3. Оба этих типа клеток экспрессируют CD44, но уровни CD44 выше в клетках A549. Обработка OPN-a снижала рост клеток CL1-5, A549 / ITGβ3, h560 / ITGβ3 и h2299 / ITGβ3 по сравнению с необработанными клетками. Эти результаты предполагают, что ITGβ3 необходим для ингибирования роста, индуцированного OPN-a. Иммуноокрашивание показало, что обработка OPN-a значительно снижает мембранные и общие уровни ITGβ3.Возможно, что связывание OPN-a с ITGβ3 вызывает интернализацию и дестабилизацию ITGβ3, а также других связанных рецепторов роста.

Нокдаун экспрессии ITGβ3 в клетках CL1-5 не только отменял индуцированное OPN-a ингибирование роста, но также усиливал индуцированный OPN-a рост клеток. В отсутствие ITGβ3 OPN-a увеличивал рост клеток по пути CD44 / NFκB. В соответствии с этим результатом обработка OPN-a значительно повышала уровни CD44 в мембране после индуцированного si-РНК нокдауна ITGβ3.Основываясь на этих результатах, мы предполагаем, что в отсутствие OPN-a ITGβ3 увеличивает рост за счет связывания с фактором роста или активации рецептора роста (рисунок). Повышенные уровни OPN-a в окружающей среде блокируют связывание ITGβ3 с факторами роста, тем самым снижая рост клеток. Альтернативно, связывание OPN-a с ITGβ3 может приводить к интернализации ITGβ3, а также ассоциированных рецепторов роста, таким образом подавляя рост клеток. (Фигура ). Напротив, когда уровни ITGβ3 низкие, OPN-a связывается, стабилизирует и активирует CD44, который, в свою очередь, активирует сигналы роста (рисунок).Наконец, в отсутствие OPN-a ITGβ3 необходим для роста клеток CL1-5 (рисунок).

Схематическая диаграмма опосредованной OPN-a и ITGβ3 регуляции роста

A. В отсутствие OPN-a ITGβ3 связывается с сигнальной молекулой (сигнал роста, молекула окружающей среды или рецептор роста) для поддержания роста CL1 -5 ячеек. B. Нокдаун ITGβ3 снижает рост клеток. C. OPN-a может конкурировать с молекулами сигнала роста за связывание ITGβ3 или вызывать интернализацию ITGβ3 или комплекса ITGβ3 / рецептор роста, таким образом снижая рост клеток. D. Нокдаун ITGβ3 позволяет OPN-a связываться с альтернативным рецептором CD44, что увеличивает локализацию CD44 в мембране и увеличивает рост за счет активации NFκB.

OPN опосредует миграцию клеток через различные интегрины, включая αvβ1, αvβ3, αvβ5, α4β1, α5β1, α8β1 и α9β1 (обзор в [13]). Среди гетеродимеров интегрина αvβ3 чаще всего ассоциируется со злокачественными новообразованиями, индуцированными OPN. Комплекс αvβ3 участвует в индуцированной OPN миграции и инвазии в опухолевые клетки [27, 28], а также в индуцированной OPN миграции эндотелиальных клеток и ангиогенезе [29, 30].Кроме того, лигирование OPN с CD44 увеличивает клеточную адгезию, инвазию и трансформацию [13, 31]. OPN напрямую взаимодействует с интегрином β3 и CD44 [32, 33]; последовательности RGD и SVVYGLR в OPN ответственны за его взаимодействие с интегрином [34], в то время как сайты связывания CD44 в последовательности OPN еще не идентифицированы. Интересно, что OPN действует как связующая молекула между вариантами CD44 и интегринами, чтобы стимулировать подвижность в мышиных клетках [5]. Взаимодействие между OPN и αvβ3 увеличивает экспрессию CD44v6 в клетках HepG2 и усиливает клеточную адгезию к гиалуроновой кислоте [35].Кроме того, связывание OPN-a с вариантами CD44 активирует интегрины через Src, тем самым способствуя сигналам выживания, полученным из ECM, при раке желудка [36].

Хотя повышающая регуляция OPN в плазме или раковых тканях связана с плохим прогнозом рака, наши результаты ясно демонстрируют, что OPN-a, но не OPN-b или -c, снижает рост клеток CL1-5. Причина, по которой сверхэкспрессия OPN-α подавляет рост этих раковых клеток, неизвестна. OPN способствует миграции иммунных клеток к месту раны.Однако было показано, что ОПН, полученный из опухоли, подавляет функцию макрофагов и способствует росту опухоли [37]. Способность опухолевых клеток уклоняться от иммунитета хозяина может быть результатом снижения продукции NO макрофагами в ответ на ОПН, полученный из опухоли [38]. Также неизвестно влияние различных изоформ OPN на иммунитет. Вариант сплайсинга OPN-a, который наиболее сильно экспрессируется в опухолевых клетках, может помочь подавить иммунный надзор. Кроме того, мы обнаружили, что фибробласты, обработанные OPN-a, могут секретировать молекулы, которые усиливают рост клеток рака легких.(данные не показаны)

Наше исследование показало, что уровни экспрессии ITGβ3 и CD44 определяют, подавляет или усиливает OPN-a рост клеток рака легких. Кроме того, влияние ITGβ3 на рост раковых клеток определяется уровнями OPN в окружающей среде. OPN и ITGβ3 являются привлекательными мишенями для лечения рака, и целенаправленная терапия ITGβ3 (такая как циклический RGD) широко исследовалась. Наше исследование предполагает, что таргетная терапия ITGβ3 может эффективно подавлять рост OPN-отрицательных клеток, но также может увеличивать рост OPN-положительных клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование и обработка клеток

Клеточные линии NCI-A549, NCI-h33, NCI-h541 и NCI-h2355 аденокарциномы легкого (AD), NCI-h458 и NCI-h2299 немелкоклеточного легкого рак (NSCLC) и линии клеток крупноклеточной карциномы легкого NCI-h560, NCI-H661 были получены из Центра сбора и исследования биоресурсов (BCRC, Тайвань). Линии клеток легкого AD CL1-0, CL1-3 и CL1-5 были любезно предоставлены доктором П.К. Янгом (кафедра внутренней медицины, Национальный университет Тайваня, Тайбэй, Тайвань).Для анализа роста клеток клетки A549 и h2299 поддерживали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки CL1-0, CL1-5 и h560 поддерживали в среде RPMI1640, содержащей 10% FBS. RPMI, DMEM и FBS были приобретены у Gibco.

Клонирование и трансфекция

OPN-a и -b амплифицировали с помощью ПЦР с кДНК CL1-0 и клонировали в векторы pcDNA ™ 3.1 / myc -His (-) A. Для получения OPN-c был проведен сайт-направленный мутагенез на основе ПЦР для удаления экзона 4 в конструкции OPN-a.ITGβ3 амплифицировали с помощью ПЦР (прямой праймер: 5'-GCGACGGTCCGGCCACCATGCGAGCGCGG-3 '; обратный праймер: 5'-GCCACGGACCGCAGTGCCCCTGTACGTGAT-3') из кДНК CL1-5 и лигировали с вектором T / A. После секвенирования ITGβ3 был субклонирован в сайт RsrII в pcDNA 3.1 / myc-His (-) A. Вектор pcDNA был сконструирован путем вставки адаптера с сайтом рестрикции RsrII (F 'oligo: 5'-GATCCGGTCCGCAC-3'; R 'oligo: 5'-GATCGTGCGGACCG-3') в сайт BamHI и был мутирован в сайте RsrII в гене Neo r . Трансфекцию проводили реагентом для трансфекции Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.Трансфицированные клетки CL1-5 обрабатывали G418 (500 мкг / мл) (Sigma-Aldrich) в течение 3-4 недель для отбора стабильных клонов. Для РНК-интерференции siRNA (si- ITGβ3 : 5′-GGACUACGCUCUCUGAAUUTT-3 ′, si-CD44: 5′-UAUUCCACGUGGAGAAAAATT-3 ′, si-p65: 5′-CCUUUCUCAUCCCAUCUU, или si-p65: 5′-CCUUUCUCAUCCCAUCUU, '-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' (предоставленный MDBio, Inc, Тайвань) трансфицировали в клеточные линии с использованием липофектамина, а затем клеточные линии культивировали в течение 24 часов. Затем трансфицированные клетки переносили в подходящую среду для анализа.

Вестерн-блоттинг

Клетки лизировали лизисным буфером, содержащим 0,5% NP-40, 50 мМ трис-Cl (pH 7,5), 1 мМ EDTA и коктейль ингибиторов протеазы (Roche) в течение 3 мин. Затем клеточный дебрис удаляли центрифугированием и определяли концентрацию белка с использованием набора для анализа белков Брэдфорда (Bio-Rad). Равные количества белка разделяли на гелях додецилсульфат-полиакриламид натрия (SDS-PAGE) и затем переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) (Perkin Elmer).После блокирования мембраны инкубировали с анти-Flag (Sigma), анти-OPN (# 10A16 или # O17, IBL10011, 18625.), анти-ITGβ3 (Abcam ab75872) или антителами против p65 (Millipore, 06-418). ) при 4 ° C в течение ночи с последующей инкубацией с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, при комнатной температуре в течение 1 часа. Блоты визуализировали с использованием набора для усиленной хемилюминесценции (ECL) (Perkin Elmer).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

клеток CL1-5 (3 × 10 5 клеток / лунку) высевали на 6-луночные планшеты и культивировали до 70% конфлюэнтности.Затем клетки трансфицировали si-NC или si-ITGβ3 или без них, используя липофектамин, и инкубировали в течение 24 часов. Трансфицированные клетки высевали (1,5 × 10 5 клеток) на покровные стекла. После 16-часовой инкубации клетки обрабатывали 0,5 мкг / мл OPN-a в течение 24 часов. Затем клетки фиксировали 100% метанолом в течение 10 минут при -20 ° C с последующим блокированием 3% BSA в течение еще 60 минут при комнатной температуре. Затем фиксированные клетки зондировали антителом против интегрина β3 (разведение 1: 200; Abcam ab75872) или CD44 (разведение 1: 200; GeneTex Gtx102111) в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей инкубацией с TRITC или F488-конъюгированной козой. антитела против кроличьего IgG (разведение 1: 500; Sigma, St.Луис, Миссури, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем клетки трижды промывали PBS, окрашивали DAPI в течение 15 мин и наносили на них монтажный раствор. Экспрессию и расположение целевых белков наблюдали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа.

Иммунопреципитация

Для иммунопреципитации CD44 5 × 10 6 CL1-5 / OPN-a клетки лизировали буфером RIPA (50 мМ Трис, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1% натрия дезоксихолат, 2 мМ EDTA 2, 1 мМ PMSF, ингибитор протеазы и ингибитор фосфатазы).Лизат (1 мг белка) инкубировали с 4 мкг антитела против CD44 (Abcam, ab157107) в течение ночи при 4 ° C. Затем к смеси белок-антитело добавляли промытые шарики с протеином G (50 мкл, MagQu, MF-PRG-3000) с последующей инкубацией в течение 5 ч при 4 ° C. После промывки белковый комплекс выделяли нагреванием при 95 ° C в течение 3 минут в загрузочном буфере. CD44 и OPN были разделены с помощью SDS-PAGE, и иммуноблоты были затем зондированы антителами против CD44 (Abcam ab157107) и против OPN (O17, IBL 18625).

Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК (2 мкг) экстрагировали из тканей и клеточных линий с помощью реагента TRIZOL (Invitrogen), обрабатывали ДНКазой RQ1 (Promega # M6101) и подвергали синтезу кДНК в соответствии с инструкциями производителя. инструкция (Эпицентр RT80125K).Все реакции ПЦР в реальном времени проводили с помощью системы ABI StepOne с использованием FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche). Для ПЦР в реальном времени использовали следующие праймеры: 18S рРНК -F, 5'-TCGGAACTGAGGCCATGA-3 'и 18S рРНК -R, 5'-CCGGTCGGCATCGTTTA-3'. Праймеры для обнаружения изоформ OPN были следующими: 5'-CATCACCTGTGCCATACCA-3 '(расположенный в экзоне 2) и 5'-GGCTGTCCCAATCAGA-3' (расположенный в экзоне 6). Праймеры для обнаружения интегринов были следующими: ITGα3 -F, 5'-TGCTCACCCCTCACTCCT-3 '; ITGα3 -R, 5'- GGCAGTCCCAGCTTCTCT-3 '; ITGα4 -F, 5'- GCT CGGGAGCAGTAATGAA-3 '; ITGα4 -R, 5'- ATCTGCA CGGCCATTGTA-3 '; ITGα5 -F, 5'-CCCTGCCGCTCAG ATTT-3 '; ITGα5 -R, 5'- CTGGCCTGGCGAGTCT-3 '; ITGαv -F, 5'- CAAAGCAAACACCACCCA-3 '; ITGα9 -F, 5'- GTGATGCCGGTGGGATA-3 '; ITGα9 -R, 5'- CCGGGAGGAAGATGGA-3 '; ITGαv -R, 5'-GGG GCACAGGCCAA-3 '; ITGβ1 -F, 5'-CGTAGCAAAG GAACAGCAGA-3 '; ITGβ1 -R, 5'- AGTCCGAAGTA ATCCTCCTCA-3 '; ITGβ3 -F, 5'-GGCCCCTCA GCGACA-3 '; ITGβ3 -R, 5'- AATGCCCCGAAGCCA-3 '; ITGβ5 -F, 5'- TGGCTGGCGAAAGGAT-3 '; ITGβ5 -R, 5'- GCAAGGCAAGGGATGGAT-3 '.Праймеры для обнаружения вариантов CD44 были следующими: CD44, -F, 5'-TCTACCCCAGCAACCCTACT-3 '; CD44 -R, 5'- CCACCTTCTTGACTCCCATGT-3 '; CD44v6 -F, 5'-TCC AGGCAACTCCTAGTAGTACA-3 '; CD44v6 -R, 5'- GGT GTGAGATTGGGTTGAA-3 '; CD44v8 -F, 5'- CGC TTCAGCCTACTGCAA-3 '; CD44v8 -R, 5'- GGGT CTCTTCTTCCACCTGT-3 '.

Анализ роста клеток

Клетки культивировали до 70% конфлюэнтности. После отсоединения 3 × 10 4 клеток высевали на 12-луночные планшеты и культивировали в RPMI-1640 (для CL1-5) или DMEM (для A549), содержащей 10% FBS с CM или очищенным OPN-a или без него.После 16 ч инкубации клетки собирали и подсчитывали жизнеспособные клетки; этот момент времени был обозначен как 0 ч. После дополнительных 24 ч инкубации клетки собирали и подсчитывали жизнеспособные клетки; этот момент времени был обозначен как 24 часа. Для скрининга ингибиторов пути инокулировали 3 × 10 4 клеток и инкубировали в течение 16 часов. Затем клетки либо собирали перед обработкой (обозначено как 0 часов), либо обрабатывали различными ингибиторами в течение 48 часов (обозначено как 48 часов), и подсчитывали жизнеспособные клетки.Кратное изменение количества клеток рассчитывали путем деления количества жизнеспособных клеток через 24 часа (или 48 часов) на количество клеток через 0 часов. Относительное кратное изменение количества клеток рассчитывали путем деления каждого кратного изменения в обрабатываемых клетках на кратное изменение в контрольных клетках.

Анализ формирования фокуса

Для анализа формирования фокуса 200 клеток высевали на чашку диаметром 3,5 см. После инкубации в течение 7–9 дней колонии фиксировали 100% ледяным метанолом в течение 30 минут с последующим окрашиванием 20% Гимза в течение 30 минут.

Очистка OPN-a из CM / OPN-a

Для очистки эктопически экспрессированного OPN-a стабильный клон CL1-5 / OPN-a-Myc-His или клетки CL1-5 / VC выращивали до 100% слияния. в посуде диаметром 10 см. Среду заменяли 4 мл бессывороточной среды RPMI с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 24 часов. Собирали около 120 мл КМ и концентрировали с помощью центробежного концентратора Vivaspin® 15R до примерно 5 мл с последующей инкубацией с равным объемом гранул агарозы Ni-NTA (QIAGEN) при 4 ° C в течение 2 часов.После промывания промывочным буфером (50 мМ Na 2 HPO 4 , 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,05% Твин 20, pH 8,0) OPN-a элюировали элюирующим буфером (50 мМ Na 2 HPO 4 , 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, 0,05% Твин 20, pH 8,0). Для удаления имидазола элюент подвергали диализу против 1xPBS. Концентрацию очищенного OPN-a определяли с использованием набора для анализа белка Брэдфорда (Bio-Rad).

Приготовление кондиционированной среды

Кондиционированную среду (CM) получали из клеток, временно или стабильно трансфицированных различными вариантами сплайсинга OPN.Все клетки выращивали до полного слияния в среде для выращивания с 10% FBS, которую затем заменяли 2 мл свежей среды с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 24 часов в чашках диаметром 3,5 см. После удаления клеточного дебриса центрифугированием CM смешивали с равными объемами свежей среды, содержащей 10% FBS, для анализов клеточных культур.

Статистический анализ

Все анализы роста, за исключением эксперимента по анализу ингибитора пути, независимо повторяли по крайней мере раз с тремя повторностями в каждом эксперименте.Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение. Для статистического анализа использовали программное обеспечение GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния, http://www.graphpad.com). Статистическая значимость оценивалась с помощью тестов Стьюдента t и выражалась следующим образом: * , p <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001 .; ### , p <0,001; +++ , p <0,001.

Благодарности

Мы благодарим доктора Х.Цзюнн-Лян Ко, д-р Вэнь-Цзюнь Ву и д-р Хуэй Ли за их экспертные консультации и советы, а Цзинъяо Чан за финансовую поддержку этой работы.

Сноски

КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ПОДДЕРЖКА ГРАНТА

Эта работа была поддержана грантом Национального научного совета NSC 102-2320-B-040-010-MY2 (Тайвань, Р.О.К.) Цзинхуа Цай Чангу.

ССЫЛКИ

1. Сенгер Д.Р., Вирт Д.Ф., Хайнс РО.Трансформированные клетки млекопитающих секретируют специфические белки и фосфопротеины. Клетка. 1979; 16: 885–893. [PubMed] [Google Scholar] 2. О'Реган А., Берман Дж. С.. Остеопонтин: ключевой цитокин при клеточно-опосредованном и гранулематозном воспалении. Международный журнал экспериментальной патологии. 2000. 81: 373–390. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Yokosaki Y, Tanaka K, Higashikawa F, Yamashita K, Eboshida A. Четкие структурные требования для связывания интегринов alphavbeta6, alphavbeta3, alphavbeta5, alpha5beta1 и alpha9beta1 с остеопонтином.Matrix Biol. 2005; 24: 418–427. [PubMed] [Google Scholar] 4. Вебер Г.Ф., Ашкар С., Глимчер М.Дж., Кантор Х. Взаимодействие рецептор-лиганд между CD44 и остеопонтином (Эта-1) Science (New York, NY. 1996; 271: 509–512). [PubMed] [Google Scholar] 5. Катагири YU, Sleeman J, Fujii H, Herrlich P, Hotta H, Tanaka K, Chikuma S, Yagita H, Okumura K, Murakami M, Saiki I, Chambers AF, Uede T. Варианты CD44, но не CD44, взаимодействуют с бета1-содержащими интегринами для позволяют клеткам связываться с остеопонтином независимо от аргинин-глицин-аспарагиновой кислоты, тем самым стимулируя подвижность клеток и хемотаксис.Исследования рака. 1999. 59: 219–226. [PubMed] [Google Scholar] 6. Cui R, Takahashi F, Ohashi R, Gu T, Yoshioka M, Nishio K, Ohe Y, Tominaga S, Takagi Y, Sasaki S, Fukuchi Y, Takahashi K. Отмена взаимодействия между остеопонтином и интегрином alphavbeta3 снижает рост опухоли человека. клетки рака легких у мышей. Рак легких. 2007. 57: 302–310. [PubMed] [Google Scholar] 7. Yin M, Soikkeli J, Jahkola T., Virolainen S, Saksela O, Holtta E. Остеопонтин способствует инвазивному росту клеток меланомы, активируя интегрин alphavbeta3 и подавляя тетраспанин CD9.Американский журнал патологии. 2014; 184: 842–858. [PubMed] [Google Scholar] 8. Sangaletti S, Tripodo C, Sandri S, Torselli I, Vitali C, Ratti C, Botti L, Burocchi A, Porcasi R, Tomirotti A, Colombo MP, Chiodoni C. Остеопонтин формирует иммуносупрессию в метастатической нише. Исследования рака. 2014; 74: 4706–4719. [PubMed] [Google Scholar] 9. Boyerinas B, Zafrir M, Yesilkanal AE, Price TT, Hyjek EM, Sipkins DA. Адгезия к остеопонтину в нише костного мозга регулирует состояние покоя лимфобластных лейкозных клеток.Кровь. 2013; 121: 4821–4831. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 10. Кария Ю., Канно М., Мацумото-Морита К., Конно М., Ямагути Ю., Хашимото Ю. О-гликозилирование остеопонтина способствует его свойствам фосфорилирования и клеточной адгезии. Биохимический журнал. 2014; 463: 93–102. [PubMed] [Google Scholar] 11. Так А.Б., О'Мэлли Ф.П., Сингхал Х., Тонкин К.С., Харрис Дж.Ф., Баутиста Д., Чемберс А.Ф. Экспрессия остеопонтина и р53 связана с прогрессированием опухоли в случае синхронных двусторонних инвазивных карцином молочной железы.Архивы патологии и лабораторной медицины. 1997; 121: 578–584. [PubMed] [Google Scholar] 12. Ue T, Yokozaki H, Kitadai Y, Yamamoto S, Yasui W, Ishikawa T., Tahara E. Совместная экспрессия остеопонтина и CD44v9 при раке желудка. Международный журнал рака. 1998. 79: 127–132. [PubMed] [Google Scholar] 13. Вай ПЙ, Го ПК. Остеопонтин: регуляция метастазирования опухоли. Отзывы о метастазах рака. 2008. 27: 103–118. [PubMed] [Google Scholar] 14. Шидзубо Н., Уэде Т., Кон С., Маэда М., Сегава Т., Имада А., Хирасава М., Абэ С.Фактор роста эндотелия сосудов и остеопонтин при аденокарциноме легких I стадии. Американский журнал респираторной медицины и реанимации. 1999; 160: 1269–1273. [PubMed] [Google Scholar] 15. Чемберс А.Ф., Уилсон С.М., Керквлит Н., О'Мэлли Ф.П., Харрис Дж.Ф., Кассон А.Г. Экспрессия остеопонтина при раке легких. Рак легкого (Амстердам, Нидерланды) 1996; 15: 311–323. [PubMed] [Google Scholar] 16. Так А.Б., О'Мэлли Ф.П., Сингхал Х., Харрис Дж.Ф., Тонкин К.С., Керквлит Н., Саад З., Дойг Г.С., Чемберс А.Ф. Экспрессия остеопонтина в группе больных раком молочной железы без лимфоузлов.Международный журнал рака. 1998. 79: 502–508. [PubMed] [Google Scholar] 17. Агравал Д., Чен Т., Ирби Р., Квакенбуш Дж., Чемберс А.Ф., Сабо М., Кантор А., Коппола Д., Йитман Т.Дж. Остеопонтин идентифицирован как ведущий маркер прогрессирования рака толстой кишки с использованием профилей экспрессии объединенного образца. Журнал Национального института рака. 2002; 94: 513–521. [PubMed] [Google Scholar] 18. Гото М., Сакамото М., Канетака К., Чуума М., Хирохаши С. Сверхэкспрессия остеопонтина при гепатоцеллюлярной карциноме. Патология международная.2002; 52: 19–24. [PubMed] [Google Scholar] 19. Thalmann GN, Sikes RA, Devoll RE, Kiefer JA, Markwalder R, Klima I, Farach-Carson CM, Studer UE, Chung LW. Остеопонтин: возможная роль в прогрессировании рака простаты. Clin Cancer Res. 1999; 5: 2271–2277. [PubMed] [Google Scholar] 20. Сайто Й., Курацу Дж., Такешима Х., Ямамото С., Ушио Ю. Экспрессия остеопонтина в глиоме человека. Его корреляция со злокачественным новообразованием. Лабораторное исследование; журнал технических методов и патологии. 1995. 72: 55–63. [PubMed] [Google Scholar] 21.Хе Б., Мирза М., Вебер Г.Ф. Вариант сплайсинга остеопонтина индуцирует независимость закрепления в клетках рака груди человека. Онкоген. 2006; 25: 2192–2202. [PubMed] [Google Scholar] 22. Чае С., Чжун Хо, Ли ЭГ, Ян С.Дж., Ли Д.К., Чон Дж.К., Пак К.С., Йом Йи, Ким К.В. Варианты сплайсинга остеопонтина по-разному модулируют миграционную активность клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы. Международный журнал онкологии. 2009; 35: 1409–1416. [PubMed] [Google Scholar] 23. Тилли TM, Мелло К.Д., Феррейра Л.Изоформы сплайсинга как остеопонтина-с, так и остеопонтина-b играют про-туморогенные роли в клетках рака простаты. Простата. 2012; 72: 1688–1699. [PubMed] [Google Scholar] 24. Goparaju CM, Pass HI, Blasberg JD, Hirsch N, Donington JS. Функциональная гетерогенность изоформ остеопонтина при немелкоклеточном раке легкого. J Thorac Oncol. 5: 1516–1523. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 25. Чуанг CY, Чанг Х, Лин П, Сун SJ, Чен PH, Лин YY, Шеу GT, Ко JL, Сюй SL, Чанг JT. Повышающая регуляция экспрессии остеопонтина арилуглеводородным рецептором через лиганд-зависимые и лиганд-независимые пути при раке легких.Ген. 2012; 492: 262–269. [PubMed] [Google Scholar] 26. Bourguignon LY, Xia W, Wong G. Опосредованное гиалуронаном взаимодействие CD44 с p300 и SIRT1 регулирует передачу сигналов бета-катенина и специфическую транскрипционную активность NFkappaB, приводящую к экспрессии генов MDR1 и Bcl-xL и химиорезистентности в опухолевых клетках молочной железы. Журнал биологической химии. 2009. 284: 2657–2671. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 27. Chen YJ, Wei YY, Chen HT, Fong YC, Hsu CJ, Tsai CH, Hsu HC, Liu SH, Tang CH. Остеопонтин увеличивает миграцию и активацию MMP-9 через интегрин alphavbeta3, FAK, ERK и NF-kappaB-зависимый путь в клетках хондросаркомы человека.Журнал клеточной физиологии. 2009; 221: 98–108. [PubMed] [Google Scholar] 28. Фонг Ю.К., Лю С.К., Хуанг С.Й., Ли ТМ, Сюй С.Ф., Као С.Т., Цай Ф.Дж., Чен В.С., Чен С.Й., Тан С.Х. Остеопонтин увеличивает миграцию клеток рака легких за счет активации интегрина alphavbeta3 / FAK / Akt и NF-kappaB-зависимого пути. Рак легкого (Амстердам, Нидерланды) 2009; 64: 263–270. [PubMed] [Google Scholar] 29. Dai J, Peng L, Fan K, Wang H, Wei R, Ji G, Cai J, Lu B, Li B, Zhang D, Kang Y, Tan M, Qian W, Guo Y. Остеопонтин индуцирует ангиогенез посредством активации PI3K / AKT и ERK1 / 2 в эндотелиальных клетках.Онкоген. 2009. 28: 3412–3422. [PubMed] [Google Scholar] 30. Senger DR, Ledbetter SR, Claffey KP, Papadopoulos-Sergiou A, Peruzzi CA, Detmar M. Стимуляция миграции эндотелиальных клеток с помощью фактора проницаемости сосудов / фактора роста эндотелия сосудов посредством кооперативных механизмов с участием интегрина alphavbeta3, остеопонтина и тромбина. Американский журнал патологии. 1996. 149: 293–305. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 31. Терамото Х, Кастеллоне, доктор медицины, Малек Р.Л., Летвин Н., Фрэнк Б., Гуткинд Дж. С., Ли Н.Х.Аутокринная активация пути остеопонтин-CD44-Rac усиливает инвазию и трансформацию H-RasV12. Онкоген. 2005; 24: 489–501. [PubMed] [Google Scholar] 32. Айлан С., Лонг П., Дженнер П., Роуз С. Экспрессия интегрина и рецепторов CD44, распознающих остеопонтин, в нормальной и поврежденной ЛПС черной субстанции крыс. Eur J Neurosci. 2013; 38: 2468–2476. [PubMed] [Google Scholar] 33. Dalal S, Zha Q, Daniels CR, Steagall RJ, Joyner WL, Gadeau AP, Singh M, Singh K. Остеопонтин стимулирует апоптоз в сердечных миоцитах взрослых через участие рецепторов CD44, путь гибели митохондрий и стресс эндоплазматического ретикулума.Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2014; 306: h2182–1191. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 34. Ван К.Х., Денхардт Д.Т. Остеопонтин: роль в иммунной регуляции и стрессовых ответах. Обзоры цитокинов и факторов роста. 2008. 19: 333–345. [PubMed] [Google Scholar] 35. Гао Ц., Го Х.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *