Содержание

Мин 1 индикатор напряжения цена

Основные атрибуты
Страна производительСССР Россия
СостояниеНовое
ФункцииПрозвонка цепи
МониторНет
ИндикацияСветовая
ПитаниеСеть от 110В
Напряжение500.0 (В)

Показать все

Индикатор напряжения МИН 1​

Цена указана без НДС и действительна при оплате на ООО. При оплате на ИП возможна скидка до -30%.

Назначение.
МИН1 предназначен для работы в электрических цепях с частотой тока 50 Гц и напряжением от 110В до 500В.

Делаем доставку по городам и регионам: Москва, Тверь, Тула, Брянск, Липецк, Смоленск, Нижний Новгород, Ярославль, Вологда, Санкт-Петербург, Петрозаводск, Казань, Ульяновск, Пенза, Самара, Саратов, Волгоград, Ростов-на-Дону, Краснодар, Ставрополь, Владикавказ, Махачкала, Уфа, Оренбург, Челябинск, Мурманск, Салехард, Ханты-Мансийск, Омск, Тюмень, Барнаул, Абакан, Красноярск, Иркутск, Чита, Хабаровск, Владивосток, Майкоп, Улан-Удэ, Горно-Алтайск, Назрань, Нальчик, Элиста, Черкесск, Петрозаводск, Сыктывкар, Йошкар-Ола, Саранск, Якутск, Казань, Кызыл, Ижевск, Чебоксары, Благовещенск, Архангельск, Астрахань, Белгород, Владимир, Воронеж, Иваново, Калининград, Калуга, Петропавловск-Камчатский, Кемерово, Киров, Кострома, Курган, Курск, Магадан, Великий Новгород, Новосибирск, Орел, Пермь, Псков, Рязань, Южно-Сахалинск, Екатеринбург, Тамбов, Томск, Анадырь и т. д.

  • 2 — с хранения
  • Описание
  • Предложить цену
  • Наличие
  • Характеристики
    Номенклатурная группаиндикатор напряжения
    Базовая единицашт
    МодельМИН-1

    Вы можете задать любой интересующий вас вопрос по товару или работе магазина.

    Наши квалифицированные специалисты обязательно вам помогут.

    Предложить цену

  • Персональные рекомендации

© LLC AMEO 2006 — 2019
Automation and Electrical
Marine Equipment

Указатель напряжения УННУ-1Н 50-1000В

Указатель напряжения WN-1-1

Стабилизатор напряжения Uniel (09496) 500ВА RS-1/500LS

Указатели напряжения F&F WN-1 (ЕА04. 007.006)

Указатель напряжения УННУ-1Н, световой индикатор, поляр.

Указатель высокого напряжения УВН80-2М 6-10кВ с газораз.

Указатели напряжения F&F WN-1 (ЕА04.007.006)

Указатель тока цифровой F&F WT-1 (ЕА04.008.001)

Указатель напряжения ЭИ-9000 от 50-1000В

Индикатор напряжения ПИН-90М 50В-1000В переменного и по.

Указатель напряжения ЭЛИН-1 СЗ с испытанием

Указатель напряжения СЕМ DT-9902

указатели напряжения тока F&F WN-1 230в

IEK Мультиметр MY64 + индикатор напряжения ОП-1 TMD-5S-.

Однофазный индикатор напряжения V1F (2 модуля)

Указатель напряжения ЭЛИН-1 СЗ ИП М с испытанием

Указатель напряжения однофазный LK-712 (EA04.007.001)

Указатель напряжения УНН-1Д (40-1000В) Диэлектрик

Указатель напряжения ПИН-90М ВЛ (UNN102)

Указатель напряжения “WN-1-1”, 1 фаза, 230 В.

Указатель напряжения УНН-1 СЗ ИП с испытанием

тестер напряжения yato 1. 5-9v 70-250v звуковой

Указатель напряжения “WN-1-1”, 1 фаза, 230 В.

Указатель напряжения ПИН-90

Указатель напряжения и правильности подключения DT-9021.

Указатель напряжения ЭИ-9000, световой индикатор, поляр.

Вольтметр (индикатор напряжения) РН-11 1-ф, диапазон из.

Указатель напряжения Евроавтоматика F&F WN-1-1, 230.

Измерительные приборы UNIT Индикатор напряжения Unit UT.

Однофазный индикатор напряжения V1F (2 модуля) (за 1шт.

DMV-1T указатель напряжения

Измерительные приборы UNIT Индикатор напряжения Unit UT.

Указатель напряжения Мегеон 55001

Указатель низкого напряжения унн-1 д 40-1000В диэлектри.

Указатель напряжения WN-1, однофазный, 100-300В, цифров.

Zamel Указатель уровня напряжения 1Ф 195-245VAC IP20 на.

Указатель напряжения трехфазный LK-713 (EA04.007.002)

Указатель напряжения Евроавтоматика F&F WN-1-1, 230.

Указатель напряжения УН-1Н-М с испытанием

Измерительные приборы UNIT Индикатор напряжения Unit UT.

Указатель низкого напряжения Контакт 53 ЭМ (UNN127)

Детектор напряжения FLUKE 1AC-E2-II

Беcконтактный индикатор напряжения Fluke LVD1A с фонаре.

Указатель напряжения wn-1-1 (1ф 100-300в цифр. индик. 3.

Индикатор напряжения IEK ОП-2Э

Однофазный индикатор тока и напряжения VA1F (2 модуля).

Zamel Указатель уровня напряжения 1Ф 195-245VAC IP20 на.

Указатель высокого напряжения увн-10 д световая индикац.

Детектор напряжения — 5 шт FLUKE 1AC-E1-II-5PK

Индикаторы напряжения, тестеры, пробники по лучшим ценам

Поиск по сайту

Каталог товаров

Мы рекомендуем
Хит продаж
Планшетный цифровой осциллограф tBook mini
Micsig TO1102

Рекомендуем
Измеритель мощности лазерного излучения
Sanwa LP1

Наш адрес
г. Нижний Новгород,
ул. Касьянова, 6Г
Торговый Комплекс “ФОРУМ”
Корпус 4, место и-3
E-mail: microm[email protected]
Тел: (831) 423-64-15
Каталоги PDF

Лучшие предложения

 

 

  • Детектор предназначен для обнаружения скрытой электропроводки, металлических и деревянных конструкций в толще стен.
  • Обнаружение скрытой проводки: минимально 100 В переменного напряжения на глубине до 40 мм.
  • Обнаружение металла: минимальная толщина 15 мм на глубине до 24 мм.
  • Обнаружение дерева: минимальная толщина 10 мм на глубине до 20 мм.
  • Световая и звуковая сигнализация.
  • Габаритные размеры: 160 х 63 х 37 мм
  • Питания: батарея 9 В (6F22)
  • Вес: 140 гр
7947 просмотров    Рейтинг товара: 4.1    Голосов: 11

 

  • Измеряемый диапазон: 100-240V AC 50/60 Hz
  • Наличие высокого напряжения индицируется вспышками красного светодиода в наконечнике детектора
  • Питание: 2 батареи AAA
  • Рабочая температура: -0 °С…+55 °С
  • Защита 600V по CAT III
  • Вес 40гр
  • Размеры: 148мм x 20мм x 25мм
Мы рекомендуем
7457 просмотров    Рейтинг товара: 4. 8    Голосов: 5

 

  • Дисплей показа замера напряжений: 12 – 690 В; 6 – 690 В(UT15C)
  • Светодиодная информация по диапазонам измерений: 12/24/50/120/230/400/690
  • Погрешность измерений: ±3% +5
  • Выбор диапазона измерений: автоматический
  • Светодиодная индикация выбора измерений: постоянное/переменное
  • Функция отображения превышения допустимого диапазона измерения
  • Время задержки измеряемого параметра: 0.1 сек, для ЖК-дисплея – 2 сек
  • Частотный диапазон: 0 – 400 Гц
  • Время выполнения операции: 30 сек
  • Время восстановления функций: 10 мин
  • Однополюсное измерение, диапазон: 100 – 690 В, переменное напряжение
  • Частотный диапазон: 50 – 400 Гц
  • Диапазон измерения сопротивлений: 0 – 400 кОм
  • Звуковая прозвонка на обрыв электрических соединителей
  • Тест перемещения фазы: диапазон 100 – 690 В, при частоте 45 – 65 Гц
  • Предельный диапазон измерения напряжения: 690 В
  • Питание прибора: 2 х 1,5 В (LR03)
  • Габаритные размеры прибора: 255 х 70 х 28 мм
  • Вес: 200 г
6393 просмотра    Рейтинг товара: 5. 0    Голосов: 2

  • Светодиодный индикатор напряжения
  • Тестирование постоянного и переменного напряжения
  • Диапазоны тестируемого напряжения: 6 В/ 24 В/ 50 В/120 В/ 230 В/ 400 В
  • Индикация полярности постоянного тока
  • Длительность работы: не более 10 сек
  • Масса с упаковкой: 150 г
4925 просмотров    Рейтинг товара: 5.0    Голосов: 1

  • Тестирование автоматов УЗО
  • Светодиодный индикатор напряжения
  • ЖК-дисплей для отображения напряжения и частоты
  • Фиксация показаний
  • Тестирование постоянного и переменного напряжения
  • Диапазоны тестируемого напряжения: 6В/ 12В/ 24В/ 50В/ 120В/ 230В/ 400В/ 690В
  • Тестирование напряжения одним щупом
  • Возможность проверки напряжения без батареи питания
  • Прозвонка цепи: звуковая и светодиодная индикация
  • Условие по сопротивлению целостной цепи: < 100 кОм
  • Автоматическое определение полярности постоянного тока
  • Светодиодный индикатор фазы 
  • Проверка последовательности фаз 3-х фазного тока
  • Определение порядка чередования фаз: 57В … 400В, 50 … 60 Гц
  • Фонарик подсветки рабочей области
  • Индикация разряда батареи 
  • Время измерения: 30 секунд
  • Пиковый ток в измерительной цепи: менее  3,5 мА
  • Автоматический переход в ждущий режим
  • Подсветка дисплея
  • Питание: батарея  – 2 шт. х 1,5 В тип AAA
  • Комплект поставки: прибор, комплект батарей, инструкция по эксплуатации
  • Размеры: 272 х 85 х 31 мм
  • Масса: 272 г
  • Масса с упаковкой: 418 г
Мы рекомендуем
4455 просмотров    Рейтинг товара: 3.6    Голосов: 5

 

  • Тестирование автоматов УЗО
  • ЖК индикатор напряжения
  • ЖК-дисплей для отображения напряжения и частоты
  • Фиксация показаний
  • Тестирование постоянного и переменного напряжения
  • Диапазоны тестируемого напряжения: 6В/ 12В/ 24В/ 50В/ 120В/ 230В/ 400В/ 690В
  • Тестирование напряжения одним щупом
  • Прозвонка цепи: звуковая и светодиодная индикация
  • Условие по сопротивлению целостной цепи: < 100 кОм
  • Автоматическое определение полярности постоянного тока
  • Светодиодный индикатор фазы 
  • Проверка последовательности фаз 3-х фазного тока
  • Определение порядка чередования фаз: 57В … 400В, 50 … 60 Гц
  • Фонарик подсветки рабочей области
  • Индикация разряда батареи 
  • Время измерения: 30 секунд
  • Время восстановления: 4 минуты
  • Пиковый ток в измерительной цепи: менее  3,5 мА
  • Автоматический переход в ждущий режим
  • Подсветка дисплея
  • Питание: батарея  – 2 шт. х 1,5 В тип AAA
  • Комплект поставки: прибор, комплект батарей, инструкция по эксплуатации
  • Размеры: 272 х 85 х 31 мм
  • Масса: 295 г
  • Масса с упаковкой: 436 г
Мы рекомендуем
4388 просмотров    Рейтинг товара: 4.8    Голосов: 5

  • Диапазоны измерений
    – Переменное напряжение: 24 В ~ 600 В.
    – Частота: 50/60 Гц.
     
  • Основные рабочие функции
    – Звуковая индикация напряжения.
    – Световая индикация напряжения (мигающий светодиод).
    – Вибрация при обнаружении напряжения.
    – Автоматическое отключение через 3 минуты.
    – Индикация разряда батареи.
    – Питание: 1 х 1.5 В (тип АА).
Мы рекомендуем
4254 просмотра    Рейтинг товара: 4.5    Голосов: 2

  • Диапазоны измерений
    – Переменное напряжение: 90 В ~ 1000 В.
    – Частота: 50/60 Гц.
     
  • Основные рабочие функции
    – Звуковая индикация напряжения.
    – Световая индикация напряжения (мигающий светодиод).
    – Индикация разряда батареи.
    – Питание: 2 х 1.5 В (тип АА).
Мы рекомендуем
3030 просмотров    Рейтинг товара: 5.0    Голосов: 1

  • Светодиодная и звуковая сигнализация наличия напряжения и металла
  • Диапазон обнаруживаемого переменного напряжения: 20 В … 600 В, частота 50 … 500 Гц
  • Регулируемая чувствительность по напряжению
  • Расстояние обнаружения металла: < 30 мм в прямой пропорции к размеру объекта
  • Автоотключение питания: через 15 минут отсутствия активности
  • Индикация разряда батареи 
  • Двойная изоляция корпуса  
  • Питание: батарея  – 1 шт. х 12 В тип A23S
  • Диапазон рабочих температур: -10°С … +50°С
  • Рабочая относительная влажность: менее 75% 
  • Комплект поставки: прибор, батарея, инструкция по эксплуатации
  • Размеры: 157 х 24 х 20 мм
  • Масса: 42 г
  • Масса с упаковкой: 100 г
2448 просмотров    Рейтинг товара: 5.0    Голосов: 3

 

  • Дисплей показа замера напряжений: 12 – 690 В; 6 – 690 В(UT15C)
  • Светодиодная информация по диапазонам измерений: 12/24/50/120/230/400/690
  • Погрешность измерений: ±3% +5
  • Выбор диапазона измерений: автоматический
  • Светодиодная индикация выбора измерений: постоянное/переменное
  • Функция отображения превышения допустимого диапазона измерения
  • Время задержки измеряемого параметра: 0. 1 сек, для ЖК-дисплея – 2 сек
  • Частотный диапазон: 0 – 400 Гц
  • Время выполнения операции: 30 сек
  • Время восстановления функций: 10 мин
  • Однополюсное измерение, диапазон: 100 – 690 В, переменное напряжение
  • Частотный диапазон: 50 – 400 Гц
  • Диапазон измерения сопротивлений: 0 – 400 кОм
  • Звуковая прозвонка на обрыв электрических соединителей
  • Тест перемещения фазы: диапазон 100 – 690 В, при частоте 45 – 65 Гц
  • Предельный диапазон измерения напряжения: 690 В
  • Питание прибора: 2 х 1.5 В (LR03)
  • Габаритные размеры прибора: 255 х 70 х 28 мм
  • Вес: 200 г​
2297 просмотров    Рейтинг товара: 5.0    Голосов: 2

Индикаторы напряжения, тестеры, пробники

Индикаторы напряжения, тестеры, пробники представлены в широком ассортименте 19 моделей в Микромир Электроникс.
Сравнить цены на Индикаторы напряжения, тестеры, пробники, подобрать по характеристикам, ознакомиться с техническим описанием и посмотреть видео.
Купить Индикаторы напряжения, тестеры, пробники по низким ценам с доставкой по России и в страны ЕАЭС.
Вы можете оформить заказ на Индикаторы напряжения, тестеры, пробники на сайте в разделе Оплата и доставка, отправить заказ на e-mail: [email protected] или позвонить по телефону 8 929-053-64-15, узнать стоимость доставки по указанному адресу или самовывоза.
Мы постоянно следим за качеством продукции, даем гарантию на Индикаторы напряжения, тестеры, пробники и обеспечим ремонт и послегарантийное обслуживание.

Индикаторы напряжения – Энциклопедия по машиностроению XXL

Неоновые лампы — ионные приборы тлеющего разряда — применяются для сигнализации и в качестве индикаторов напряжения и тока. Лампы общего применения разделяются на сигнальные СИ и миниатюрные МН.[c.246]

Проверять наличие напряжения разрешается только с помощью индикаторов напряжения и вольтметра и в исключительных случаях — контрольной лампой.  [c.227]

Решение конкретных задач сводится к перемещению счетно-решающего элемента по точкам пространственно-временной области [Л, 7]. С помощью нуль-индикатора напряжение, получаемое в его узле, переносится на измерительный потенциометр. Результат одновременно записывают на бумагу. Когда счетно-решающий элемент находится на границе области, то в случае граничных условий первого рода с помощью делителя к граничной точке подводится известное напряжение, пропорциональное температуре поверхности. В случае граничных условий третьего рода напряжение к граничной точке подводится через дополнительное сопротивление.  [c.344]


Для проверки отсутствия или наличия напряжения на токоведущих частях электрооборудования лифта применяют указатели напряжения типа МИН-1 (рис. 1), работающие по принципу протекания активного тока, указатели типа УНН-1М (рис. 2), работающие по принципу протекания емкостного тока, индикатор напряжения ИН-92 — вольтметр (рис. 3).  [c.8]

Рис. 3. Индикатор напряжения типа ИН-92  [c.9]

Индикатор напряжения низковольтный МИН-1  [c.222]

Набор щупов № 4 с пределом измерения от 0,1 до 1 мм Индикатор напряжения. . .  [c.162]

Рис. 57. Отвертка-индикатор напряжения
Контрольная неоновая лампа может применяться в качестве индикатора напряжения в судовых сетях напряжением 80—400 в.  [c.413]

Газовая схема течеискателя включает в себя два канала (рис. 4). В один канал поступает смесь пробного газа с воздухом из области, непосредственно примыкающей к поверхности контролируемого оборудования. Во второй канал поступает воздух окружающего пространства из области, несколько отстоящей от поверхности оборудования. В состав течеискателя входят усилитель напряжения, световой и звуковой индикаторы напряжения. Сигнализация о наличии утечки осуществляется с  [c.554]

На центральном пульте расположены индикатор напряжения и тока, навигационный космический индикатор “Глобус”, индикатор давления и температуры в отсеках, бортовые часы, электролюминесцентная сигнализация основных систем, кнопки управления командно-сигналь-ным устройством, регуляторы громкости, индикатор расстояния и скорости, комбинированный электронно-лучевой индикатор, индикатор контроля программ, блок цифровой информации, индикатор шлюзования и ранца скафандра.  [c.71]

Удаление индикатора напряжения  [c.55]

Когда из-за наличия сильных помех нет возможности воспользоваться для измерений мостовыми приборами, следует применять индикатор напряжений. Измерения проводят следующим образом  [c.487]

Вращая ручку Корректор , добиться погасания световых индикаторов Выход , т. е. добиться баланса прибора. Напряжение на клеммах 8—9 прибора должно быть не более 0,5 В. Установить Корректор поочередно в левое и правое крайнее положения. При этом должны загораться индикаторы Меньше и Больше соответственно. Напряжение на клеммах 7—8 и 8—9 прибора соответственно должно быть в пределах 21—27 В. Прибор сбалансировать ручкой Корректор . При погашенных световых индикаторах напряжение на клеммах 7—8 и 8—9 должно быть не более 0,5 В.  [c.123]


Натурные испытания. Простейшим методом проверки деталей на проч-, пость и жесткость является их испытание на стенде в условиях, наиболее приближающихся к рабочим. Деформации измеряют индикаторами или тензометрами. Хорошо поддаются стендовым испытаниям многооборотные роторы, например рабочие диски центробежных или осевых компрессоров, нагруженные главным образом центробежными силами. Частоту вращения испытываемой детали постепенно увеличивают до частоты, превышающей на 20 — 40% рабочую частоту, что соответствует возрастанию напряжений на 40—100% по сравнению с расчетными. Такие испытания воспроизводят действительные условия нагружения (кроме термических напряжений, возникающих в роторах тепловых машин).  [c.159]

Некоторые котлы оборудуются индикатором хрупкости, с помощью которого можно непрерывно контролировать качество химической обработки воды, выявляя потенциальную способность воды вызывать коррозионное растрескивание под напряжением (рис. 17.3) [21, 22. Для этого испытывается образец из пластически деформированной котельной стали. Образец находится в напряженном состоянии, которое создается отжимным винтом. Положением винта регулируется слабый ток горячей котловой воды к участку образца, который испытывает наибольшее растягивающее напряжение. На этом же участке вода испаряется. Считается, что котловая вода не вызывает хрупкости стали, если образцы не подвергаются растрескиванию в течение 30-, 60-и 90-дневных испытаний. Проведение таких испытаний является достаточной мерой предосторожности, так как у пластически деформированного образца склонность к растрескиванию более выражена, чем у какого-либо участка котла. Благодаря этому можно при необходимости откорректировать режим подготовки воды, не допуская разрушения котла.  [c.282]

Электронно-лучевой индикатор (позиция 2 на рис. 5.7) служит для наблюдения за изменением температуры на оси и на поверхности пластины во времени. Цифровой вольтметр 3 используется для измерения температуры (точнее, напряжения, представляющего в АВМ температуру) в узлах модели. Цифровой индикатор 1 фиксирует машинное время в секундах.  [c.217]

Определение двуосных ОН на поверхности соединения проводится путем локальной разрезки металла вокруг области с тензодатчиками или любыми другими индикаторами напряжений, регистрирующими деформацию в разгружаемом участке [214]. ОН определяются, как и в случае с пластинами, описанном выше. Следует отметить, что при вырезке металла, находящегося в поле остаточных деформаций с небольшим градиентом, освобождение от напряжений будет полным и тензометры зафиксируют истинную упругую деформацию разгрузки. В области высокоградиентных полей остаточных деформаций разрезка металла может привести к неполному его освобождению от напряжений. При этом в определении локальных ОН могут возникнуть большие погрешности [201].  [c.270]

Основным измерительным элементом течеискателя является мост (рис. 5), в который включены чувствительные элементы 1, 3 в виде спирали из платиновой проволоки, нагреваемой электрическим током. В другие плечи моста включены сопротивления 2, 4. Чувствительные элементы вплавлены в стеклянные капилляры и вмонтированы в приемник течеискателя. Газовая схема течеискателя включает в себя два канала (рис. 6). В один канал поступает смесь пробного газа с воздухом из области, непосредственно примыкающей к поверхности контролируемого оборудования. Во второй канал поступает воздух окружающего пространства из области, несколько отстоящей от поверхности оборудования. В состав течеискателя входит усилитель напряжения, световой и звуковой индикаторы напряжения. Сигнализация о наличии утечки осуществляется с помощью светодиода, являющегося световым индикатором. В комплекте течеискателя имеются электромагнитные телефоны, предна-  [c.196]

Характер распределения поля Нр можно оценить или с помощью универсальных магнитометров, или с помощью специализированных магнитометров-индикаторов напряжений типа ИКН-1М, выпускаемых НПО Энергодиагностика (г. Реутов Московской обл.). Дополнительно для количественной оценки уровня концентрации определяется градиент (интенсивность изменения) А нормальной составляющей остаточного магнитного поля при переходе через линию концентрации напряжений = 0  [c.118]


Коррозионные испытания проводили весовым способом. После каждого опыта трубы извлекали из стенда, вырезали образцы, взвешивали и путем сравнения с исходными образцами определяли скорость коррозии. Наряду с промышленными проводили лабораторные исследования. Из труб упомянутых конструкционных материалов вырезали прямоугольные образцы размером 8X100X1,5 мм. Образцы устанавливали в специальные приспособления. С помощью винта в образцах создавали напряжения. Стрелу прогиба образцов регистрировали индикатором. Напряжения определяли по выражению  [c.56]

Верстак (рис. 47) оборудован тисками, электроточилом и специальными ящиками для хранения инструмента. В ящиках находится набор гаечных ключей (накидных, торцевых), напильников, электродрель с набором сверл, набор отверток, пассатижи, измерительные инструменты (штангенциркуль, индикатор напряжения), набор молотков, кувалда, круглогубцы и т. д.  [c.156]

Отвертка-индикатор напряжения (рис. 57) предназначена для завинчивания винтов и контроля наличия или отсутствия напряжения в проводниках и клеммах элек-  [c.131]

Персонал, обслуживающий аппаратуру дистанционного управления, должен быть обеспечен защитными средствами (галоща-ми, ковриками, резиновыми перчатками, индикаторами напряжения и др. ), а также спецодеждой.  [c.170]

В электросхеме предусмотрены блокировочные устройства. При включенном в сеть станке открывание дверей электрошкафа станка приводит к срабатыванию путевого выключателя 51, который возбуждает катушку дистанционного рас-цепителя Р1, в результате чего автоматический выключатель отключает электрооборудование станка от сети. При этом индикатор напряжения НЗ гаснет. При открывании кожуха сменных колес срабатывает микропереключатель 55, который отключает электродвигатель М1.  [c.169]

Маркируйте индикатор напряжения, который следует удалить, щелкнув по нему левой кнопкой мыщи.  [c.55]

Для настройки и измерения основных электрических параметров передающих антенн используются индикатор разности потенциалов на фидерных линиях с настроенным резонансным контуром (ИРПР), индикатор разности потенциалов апериодический (ИРПА) и индикатор напряженности поля (резонансный индикатор излучения —ИИР). Общий вид приборов показан на рис. 23.1. Индикатор напряженности предназначен для снятия ДН передающих антенн на расстоянии не более 1 км при мощности передатчика более 3 кВт. Индикатор состоит из симметричного контура, настраиваемого в резонанс блоком переменных конденсаторов, детектора, собранного по двухполупериодной схеме выпрямления па кристаллических диодах, и магнитоэлектрического прибора типа М-24. Диапазон частот 2,8—28 МГц, перекрываемый прибором, разбит а два поддиапазона I (2,8—9,3 МГц) и II (8,1—28 МГц).  [c.481]

Вторым параметром, характеризующим асимметрию в фидерном тракте, является скос волны. Скос волны заключается в том, что пучности и узлы потенциала на разноименных гароводах фидера лежат в разных сечениях. При измерении скоса индикатор напряжения перемещают поочередно по проводу одной и другой фазы фидера и находят положение минимума или максимума напряжения.  [c.484]

Во избежание погрешностей при определении КПД для намерений следует выбирать однородные участки фидера без источников отражения волн. Кроме того, при измерениях КПД необходимо также принимать меры к поддержанию постоянной мощности измерительного передатчика. Когда контроль мощности не может быть обеспечен с помощью имеющихся на передатч1ике приборов, на фидере подвешивают второй индикатор напряжения и по его показаниям судят о постоянстве мощности в период измерений. В случае необходимости с учетом показаний контрольного прибора могут быть сделаны соответствующие поправки.  [c.485]

Снятие диаграмм направленности у поверхности земли ос>щесг-вляется путем обхода антенны с индикатором напряженности поля. Индикатор перемещают вокруг антенны по окружности, центр которой совпадает с центром антенны. Радиус окружности г 212 1 Д г>6- 10L , где //—максимальный продольный я поперечный линейные размеры антенны (ширина, длина, высота) по отношению к направлению от антенны до точки наблюдения. Желательно, чтобы площадь вокруг антенны в пределах этого радиуса была ровной и свободной от различного рода сооружений. Следует стремиться к тому, чтобы высота установки индикатора в различных точках была одинаковой.  [c.486]

При измерениях диаграммы направленности необходимо поддерживать постоянство излученной антенной мощности и в каждой точке проверять уровень помех, вызванных теми или иными причинами искажений поля. При отсутствии иоиажения ооля и помех со стороны других передатчиков максимум и минимум показаний индикатора напряженности поля при поворотах его антен-иы должны иметь место при соответствующей ориентации антенны индикатора по отношению к измеряемой антенне.  [c.486]

Рис. 6. Лицевая панель микроконтроллера МКП-1-48-2 1 – корпус 2 -предохранители, включенные в цепь первичного направления 3 – выключатель Сеть и индикатор напряжения питаюш,ей сети 4 – индикаторы наличия направлений вторичных стабилизированных источников питания +5В, +12В, -5В 5 – индикатор энергонезависимого напряжения Б для модуля энергонезависимого запоминающего устройства 6 – индикатор ожидания ОЖ 7 – индикаторы (А, Р, Ш, ВП, ПП) режимов работы микроконтроллера 8 – однострочный дисплей 9 – информационные клавиши 10 – кнопка Сбр переключения микроконтроллера на ручной режим работы 11 – индикаторы состояния входов и выходов микроконтроллера 12 – переключатель режима работы микроконтроллера БА – служебный регистр СК – счётчик команд микроконтроллера № 3, № 2 – числовые значения разрядов кода операции № 1, № О – числовые значения разрядов кода операнда
Наличие напряжения может бьпъ доказано уже при помощи простой контрольной лампочки или индикатора напряжения. Правда, в этом случае определяется только, подается ли напряжение вообще. Для того чтобы определить величину приложенного напряжения, необходимо подключить вольтметр. Прежде всего при использовании вольтметра нужно установить диапазон измерения, в котором предположительно находится измеряемое напряжение Как правило, напряжение в автомобиле не превышает 14 В Исключение составляет система зажигания здесь вторичное напряжение системы зажигания может доходить до 30 ООО В. Это высокое напряжение можно измерить только при помоши специального иэмери-  [c.160]
Сначала установите при помощи индикатора напряжения, поступает пи напряжение на клемму 30 (+) а держатель реле. Для этого подключите иьщикатор напряжения к корпусу а другой )нтакт осторожно введите в клемму 30. Если вспыхивает светоизлучающий диод, то напряжение есть. Если индикатор напряжения не показывает напряжения, то по принципиальной электросхеме отыщите обрыв провода, идущего от положительного полюса аккумуляторной батареи +) к клемме 30.[c.164]

Радиооборудование (рис. 171). На паровозах радиооборудование обеспечивает локомотивной бригаде возможность поддерживать связь с поездным диспетчером, дежурными по станции и депо, машинистами локомотивов на участке. На паровозах установлена радиостанция ЖР-ЗМ. В ее комплект входит приемник, передатчик, антенна, пульт управления, громкоговоритель, микрофонная трубка с кнопкой. Питание радиостанция получает от турбогенератора. Радиостанция выполнена в виде отдельных блоков. Приемопередающее устройство радиостанции с блоком питания смонтировано в герметически закрытом металлическом ящике, который на специальных амортизаторах установлен на площадке паровоза с правой стороны у будки машиниста. Громкоговоритель (динамик) установлен в будке машиниста. Приемопередатчик состоит лз трех блоков приемника, передатчика и блока низкой частоты. Антенна выполнена из медного провода, укрепленного через изоляторы к штангам. Антенна служит для приема и передачи электромагнитных волн к приемопередающему устройству. Один конец антенны — спуск — заземлен на массу паровоза, а второй соединен с согласующим устройством радиостанции. Пульт управления радиостанцией расположен в будке машиниста. Он состоит из устройства, которое включает в себя индикатор напряжения сети, сигнальную лампу, выключатель сетевого напряжения — тумблер и пять кнопок. Тумблер служит для включения громкоговорителя и кнопки-тангенты на микрофонной трубке. Кнопки имеют обозначения ДНЦ1, ДНЦ2, ДСП и Локомотив . Они служат для вызова соответствующего абонента диспетчера, дежурного по станции и машинистов локомотивов на участке. Пятая кнопка служит для переключения радиостанции на второй канал. Сигнальная дампа указывает на включенное положение радиостанции.  [c.224]

При проведении диагностики используются индикатор механических напряжений ИМНМ-1Ф, индикаторы концентрации напряжений ИКНМ-2Ф, ИКН-1М. Метод основан на регистрации напряженности магнитного поля рассеяния Нр, характеризующей распределение остаточной намагниченности, на контролируемой поверхности изделия. При этом на поверхности вблизи стыков и на самом шве специальной зачистки не требуется. Для этого производится сканирование датчика прибора вдоль поверхности сварного стыка по всему периметру наружного диаметра конструктивного элемента аппарата и записываются полученные значения напряженности магнитного поля рассеяния Нр.  [c.215]

ЭТОМ охранный электрод образца соединяется с заземленным экраном, а высоковольтный — с указанной вершиной (рис. 3-2). В два другие плеча включаТотся переменный резистор R3 и постоянный резистор R4, шунтированный конденсатором переменной емкости С4. В такой схеме вее напряжение практически приходится на емкостные плечи, так как их сопротивление переменному току 1/(ц)С) много больше сопротивлений резисторов, включенных в другие плечи. Поэтому, несмотря на наличие высокого напряжения, можно безопасно уравновешивать мост изменением параметров R3 и С4. Для защиты цепи в случае пробоя образца предусмотрены разрядники. Индикатором равновесия моста обычно служит вибрационный гальванометр (см. ниже), зачастую включенный через усилитель.  [c.51]


определяемся с мощностью блока питания в игровом ПК / Ноутбуки и ПК

Написать эту небольшую статью меня сподвигли комментарии к последним выпускам «Компьютера месяца» — нашей постоянной рубрике, в которой предлагаются актуальные сборки игровых системных блоков. Летом, после обвала курса основных криптовалют, в продаже появилось больше видеокарт, а их цены медленно, но верно поползли вниз. На фоне этих событий я вновь стал рекомендовать наиболее интересные, на мой взгляд, модели во всех категориях ПК. Так, в июле и августе в продвинутой сборке была указана GeForce RTX 3070 Ti. Эта видеокарта славится не только аппаратным ограничением эффективности при майнинге ETH и других монет, использующих схожие алгоритмы (это ограничение, впрочем, уже частично обошли), но и довольно высоким уровнем энергопотребления. В итоге некоторые читатели усомнились, что системе с Core i5-11600K и GeForce RTX 3070 Ti будет достаточно качественного БП с честными 600-700 Вт мощности.

А еще в «Компьютере месяца» рекомендуются сборки под скорый апгрейд видеокарты — такие системы рассчитаны на установку видеокарты любого уровня быстродействия, вплоть до GeForce RTX 3090 в разгоне. Логично, что и по менеджменту питания они должны полностью соответствовать заявленным требованиям. Что ж, давайте посмотрим, какой источник питания нужно брать производительным и мощным сборкам AMD и Intel.

⇡#В предыдущей части

В моем понимании эта статья является небольшим, но логичным дополнением большого материала «Какой блок питания необходим современному игровому ПК», вышедшего на нашем сайте чуть больше двух лет назад. Прочитав его, вы узнаете:

  • как менялось энергопотребление игровых комплектующих разных лет;
  • сколько электроэнергии потребляет отдельно взятое устройство в компьютере;
  • как правильно рассчитать кабель-менеджмент для своей сборки;
  • как меняется стоимость блоков питания разной мощности и разной эффективности;
  • какая мощность необходима игровым ПК того времени;
  • на что, помимо мощности, следует смотреть при выборе блока питания;
  • какой блок питания следует выбрать, если планируется апгрейд железа и его разгон.

Действительно, за это время на нашем рынке появилось много нового железа: видеокарты серий GeForce RTX 30 и Radeon RX 6000, а также новые центральные процессоры для массовых платформ AMD AM4 и Intel LGA1200. В остальном же изменений — минимум, и большая часть раскрытых в указанной статье тем актуальна по сей день.

Давайте не будем останавливаться на моментах, связанных с доступностью комплектующих и их ценами, а сконцентрируемся на конкуренции между извечной троицей AMD, Intel и NVIDIA. Мы видим, что за последние два года противостояние между этими чипмейкерами вышло на совершенно другой уровень. Что на рынке центральных процессоров (и платформ для сборки игровых компьютеров), что в сегменте дискретных видеокарт наблюдается серьезная конкуренция, которая в теории выгодна конечному потребителю, то есть нам с вами. На практике же мы наблюдаем гонки, заставляющие перечисленную троицу выпускать железо, которое очень сложно назвать энергоэффективным. Еще в 2019 году самой быстрой видеокартой считалась GeForce RTX 2080 Ti, уровень энергопотребления которой  (в базовой версии)составлял 260 Вт. Сейчас же графических ускорителей с таким же или более высоким TDP (расчетная тепловая мощность) в продаже находится аж 7 штук — и это, очевидно, обратная сторона возросшей на рынке конкуренции.

Так что, как видите, нет ничего удивительного в том, что пользователи, желающие сейчас или в будущем обзавестись видеокартой уровня GeForce RTX 3070 и выше, беспокоятся о выборе подходящего блока питания. И хотя нас не удивить 250-ваттными графическими акселераторами, раньше таким повышенным энергетическим «аппетитом» обладали в основном самые быстрые версии видеокарт: Radeon VII, Radeon RX Vega 64, Radeon R9 Fury (X) и Radeon R9 390X от AMD; GeForce RTX 2080 Ti, GeForce GTX 1080 Ti и GeForce GTX 980 Ti от NVIDIA.

Центральный процессор и видеокарта — это главные потребители электроэнергии в любой системе. Очевидно, что именно они определяют то, какой блок питания должен быть установлен в системном блоке. Как и в случае с игровыми 3D-ускорителями, не уменьшается и энергопотребление центральных процессоров — не уменьшится оно и в будущем, если мы говорим о настольных высокопроизводительных системах. Только в случае с CPU мы наблюдаем определенный подвох, так как заявленные характеристики чипов отображают определенную базовую величину. Вот AMD делает поправку для своих процессоров, указывая, что речь идет о величине отвода тепловой мощности по умолчанию. В Intel аббревиатуру TDP расшифровывают как среднее значение производительности в ваттах, когда мощность процессора рассеивается (при работе с базовой частотой, когда все ядра задействованы) в условиях сложной нагрузки, определенной производителем. Очевидно, что в обоих случаях мощность чипов может быть выше указанной паспортной характеристики — для  постоянных читателей нашего сайта это не новость, но мы проиллюстрируем это еще раз далее. Следовательно, при выборе блока питания нельзя просто взять и сложить расчетную мощность основных компонентов системы. Так, например, сумма TDP Ryzen 5 5600X и GeForce RTX 3080 составляет 385 Вт, плюс еще немного «съедят» другие компоненты системы. Но по факту такая сборка может потреблять гораздо больше — особенно с учетом разгона.

Сколько конкретно вешать в ваттах? Именно это мы сейчас и проверим.

⇡#Собираем мощный игровой ПК

Итак, для проведения небольшого эксперимента я собрал четыре системы. Полный перечень всех комплектующих приведен в таблице ниже.

Продвинутая сборка
Вариант 1:
✓ AMD Ryzen 5 5600X
✓ ARCTIC Liquid Freezer II-420
✓ ASUS ROG Crosshair VIII Dark Hero
✓ G.Skill Trident Z F4-3200C14D-32GTZ
✓ Palit GeForce RTX 3080 GamingPro
✓ Intel SSDPEKKW020T8X1
✓ Seasonic FOCUS GX-650
✓ 3x Noctua NF-P12-PWM
Вариант 2:
✓ Intel Core i5-11600K
✓ ARCTIC Liquid Freezer II-420
✓ ASUS ROG Maximus XIII Hero
✓ G.Skill Trident Z F4-3200C14D-32GTZ
✓ Palit GeForce RTX 3080 GamingPro
✓ Intel SSDPEKKW020T8X1
✓ Seasonic FOCUS GX-650
✓ 3x Noctua NF-P12-PWM
Максимальная сборка
Вариант 1:
✓ AMD Ryzen 9 5900X
✓ ARCTIC Liquid Freezer II-420
✓ ASUS ROG Crosshair VIII Dark Hero
✓ G. Skill Trident Z F4-3200C14D-32GTZ
✓ ASUS ROG Strix RTX 3090 Gaming OC
✓ Intel SSDPEKKW020T8X1
✓ Seasonic PRIME TX-1000
✓ 3x Noctua NF-P12-PWM
Вариант 2:
✓ Intel Core i7-11700K
✓ ARCTIC Liquid Freezer II-420
✓ ASUS ROG Maximus XIII Hero
✓ G.Skill Trident Z F4-3200C14D-32GTZ
✓ ASUS ROG Strix RTX 3090 Gaming OC
✓ Intel SSDPEKKW020T8X1
✓ Seasonic PRIME TX-1000
✓ 3x Noctua NF-P12-PWM

Варианты с Ryzen 5 5600X и Core i5-11600K похожи на предложения из продвинутой сборки «Компьютера месяца». Системы с Ryzen 9 5900X и Core i7-11700K можно отнести к максимальной сборке. Если вы сравните перечень комплектующих из этой таблицы со списком, приведенным в сентябрьском выпуске, то увидите, что для этой статьи выбрано заметно более навороченное железо — речь идет преимущественно о матплатах и системе охлаждения центрального процессора. Сделано так специально, ведь все четыре центральных процессора оснащены разблокированным множителем — значит, их можно самостоятельно разогнать.

Выбор видеокарты для сборок «Компьютера месяца» — это настоящая головная боль для меня. В начале статьи я отмечал, что курсы BTC и ETH летом заметно снизились — вслед за ними подешевели и видеокарты. Осенью, к сожалению, ситуация развернулась. В итоге рекомендовать ту или иную видеокарту оказывается достаточно трудно, ведь за небольшой период времени все может поменяться. Вот и в сентябре в рамках продвинутой сборки уже рекомендуется GeForce RTX 3060, которая обладает заметно меньшим энергетическим аппетитом.

В итоге было решено использовать в аналоге продвинутой сборки GeForce RTX 3080, а в максимальной — GeForce RTX 3090. Видеокарта, как вы сами понимаете, является самым «прожорливым» компонентом во всех сборках. А потому мой выбор имеет ключевое значение с точки зрения итогового результата. С другой стороны, если сборку с той же GeForce RTX 3080 вытянет БП определенной мощности, то с видеокартами рангом ниже он справится и подавно.

На самом деле GeForce RTX 3080 и GeForce RTX 3070 Ti обладают схожей мощностью, и она может меняться в ту или иную сторону в зависимости от конкретной модели видеокарты. Грубо говоря, там, где сборка с GeForce RTX 3080 потребляет 550 Вт, аналогичная система с GeForce RTX 3070 Ti будет «кушать» на 30-40 Вт меньше.

Бесспорно, GeForce RTX 3090 является не только самой быстрой современной игровой видеокартой, но и самой прожорливой — но такова цена возникшей конкуренции, да и ситуации на рынке микроэлектроники в целом. Я использовал модель ASUS ROG Strix RTX 3090 Gaming OC, ее можно лицезреть в главных ролях в статье «Компьютер месяца. Спецвыпуск: на что способны самые быстрые игровые системы 2021 года». Разговор ведется об одной из самых быстрых, холодных и тихих версий GeForce RTX 3090, представленных на нашем рынке и оснащенных классической воздушной системой охлаждения. Напомню, что на нашем сайте уже выходил обзор версии ROG STRIX GeForce RTX 3080 Gaming OC. Старшая модификация получила схожую систему охлаждения, функциональность и набор фирменных фишек, таких как объемная подсветка, два режима работы и наличие сразу двух четырехконтактных коннекторов для подключения вентиляторов. Подсистема питания — такая же и насчитывает 22 фазы: 9 слева и 13 справа. Каждый канал состоит из силового каскада и дросселя. Часть фаз набрана сборками ON Semiconductor NCP303151, а часть — Texas Instruments CSD95481RWJ. 18 фаз предназначены для работы GPU и управляются парой 10-канальных ШИМ-контроллеров Monolithic Power Systems MP2888A. Еще четыре канала отвечают за работу GDDR6X-памяти.

Все это необходимо для работы устройства на практически предельных частотах — к ROG Strix RTX 3090 Gaming OC необходимо подключить три 8-пиновых разъема блока питания. При этом видеокарта потребляет больше заявленных NVIDIA 350 Вт — что не удивительно для устройства с заводским разгоном. При этом ROG Strix RTX 3090 Gaming OC можно дополнительно разогнать как по чипу, так и по памяти.

ASUS ROG Crosshair VIII Dark Hero

 

ASUS ROG Maximus XIII Hero

Для сборок AMD применялась материнская плата ROG Crosshair VIII Dark Hero, для систем Intel — ROG Maximus XIII Hero. Когда я запрашивал железо у российского представительства ASUS, единственным критерием была возможность стабильного разгона процессора, видеокарты и памяти. В результате в лабораторию приехала парочка «Героев» — и эти материнки отлично справились с поставленной задачей.

Подробный обзор ROG Crosshair VIII Dark Hero выходил на нашем сайте. Для питания процессора отведено 14 фаз (семь сдвоенных каналов) со сборками Texas Instruments X95410RR, выдерживающие нагрузку в 90 A каждый. В результате плата способна выдержать суммарный ток силой в 1260 А — это рекорд среди материнских плат ASUS для платформы AM4.

Еще две фазы отвечают за SoC-составляющую процессоров. Производитель утверждает, что в цепи питания процессора используются высококачественные конденсаторы японского производства с заявленным сроком службы не менее 10 000 часов. Управление питанием реализовано восьмиканальным ШИМ-контроллером Digi+ VRM ASP1405I.

ROG Maximus XIII Hero тоже внушает доверие и в целом имеет схожий с ROG Crosshair VIII Dark Hero конвертер питания. В плате для платформы Intel используется 8-канальный контроллер Intersil ISL69269 и семь сдвоенных фаз со сборками Texas Instruments 95410RR. Для графики и формирования SA-напряжения используются силовые каскады Texas Instruments 59880, выдерживающие нагрузку в 70 А.

Оба устройства получили весьма внушительные радиаторы охлаждения. Причем для отвода тепла от чипсета X570 ROG Crosshair VIII Dark Hero не требуется вентилятор. BIOS обоих устройств изобилует всевозможными настройками, позволяющими тонко настроить систему, а также разогнать процессор и память. Помогут вам и индикатор POST-кодов со светодиодами Q-Led, переключатель Slow_mode, а также кнопки Safe_boot, Retry, Clear CMOS и BIOS FlashBack. Наконец, в обеих платах есть поддержка PCI Express 4.0, куча M.2-портов и USB 3.2 Gen2.

 

Как уже было сказано, в этой статье разбираются далеко не самые энергоэффективные сборки. Энергопотребление тех же Core i7-11700K и Ryzen 9 5900X в приложениях, задействующих AVX-инструкции, превышает 200 Вт, а в разгоне — еще больше. Поэтому для тестирования максимальной сборки мой выбор пал на модель блока питания Seasonic PRIME TX-1000 — он тоже использовался в системе из статьи «Компьютер месяца. Спецвыпуск: на что способны самые быстрые игровые системы 2021 года».

И это — потрясающий кормилец для наших комплектующих. Блок выдает честный киловатт, так как по 12-вольтовой линии способен передать 996 Вт электроэнергии. При этом устройство имеет сертификат 80 PLUS Titanium — следовательно, его КПД не опускается ниже 90 %, а при 50-процентной загрузке в сети 230 В достигает 95 % согласно спецификациям стандарта. Однако ревью коллег свидетельствуют о том, что эффективность работы этого БП оказывается даже выше. В это же одной из ключевых особенностей сертификата  80 PLUS Titanium является высокий КПД даже при низкой нагрузке, в которой игровой ПК будет пребывать большую часть времени. Так, КПД PRIME TX-1000 не проседает ниже 90 % даже при 50-100 Вт нагрузки. Гарантия на устройство составляет 12 лет, а это значит, что БП переживет далеко не один апгрейд железа в системном блоке, и все еще будет актуален.

PRIME TX-1000 предполагает полностью модульную конструкцию — все кабели отстегиваются. Большая часть проводов имеет плоскую форму — так их проще укладывать за шасси корпуса. Примечательно, что набор кабелей позволяет подключиться сразу к двум 8-контактным разъемам питания центрального процессора, что актуально для выбранных материнских плат ASUS, но в реальности необходимо только в случае экстремального разгона железа. В наличии сразу шесть проводов PCI-E 6+2, которые позволят запитать хоть две ROG Strix RTX 3090 Gaming OC — было бы желание. За охлаждение компонентов БП отвечает 135-мм вентилятор с гидродинамическим подшипником. Он начинает вращаться только при 40 % нагрузки, но даже в активном режиме PRIME TX-1000 работает очень и очень тихо.

В аналоге продвинутой сборки использовался блок питания Seasonic FOCUS GX-650 — гиперссылка ведет на подробный обзор именно этой модели. На фоне «Прайма» серия FOCUS GX, конечно же, выглядит заметно проще, хотя в серии этих БП тоже присутствует модель мощностью в 1 кВт. Но для тестирования я попросил предоставить именно 650-ваттную версию — как наиболее ходовую для игровых сборок среднего и средне-высокого уровня быстродействия. Ватты — честные, так как по 12-вольтовой линии FOCUS GX-650 способен передать все 650 Вт электроэнергии.

Устройство тоже получило полностью модульный кабель-менеджмент. За исключением 24-пинового силового провода все остальные кабели имеют плоскую форму. Сечение всех проводов составляет типичные 18 AWG — нет ни экономии на малонагруженных «периферийных» кабелях, ни увеличенного сечения проводов в шлейфах питания видеокарт и процессора. При этом FOCUS GX-650 тоже имеет два 4+4 разъема EPS 12V и сразу четыре провода 6+2 PCI-E.

Блок питания соответствует стандарту эффективности 80 PLUS Gold. Наши тесты показали, что при нагрузке в 20 % и выше КПД блока питания не проседает ниже 93 %, а при нагрузке от 50 % — ниже 97 %. Особенности тестового стенда оказываются таковы, что в реальности КПД блока питания будет чуть ниже, но у нас все равно нет ни капли сомнений в эффективности работы FOCUS GX-650. Гарантия на устройство составляет 10 лет.

⇡#Результаты тестирования

В этой статье мы говорим про геймерские сборки, а потому наиболее интересно посмотреть, какую мощность потребляют тестовые системы именно в играх. Кто бы мог подумать, но игры по-разному нагружают GPU и CPU. Есть приложения, в которых упор идет в основном только на графику, а есть и довольно процессорозависимые. Среди нескольких протестированных игр (Horizon Zero Dawn, Watch Dogs Legion, HITMAN 3, Battlefield V, The Witcher III, GTA V, Red Dead Redemption 2, Final Fantasy XIV, Shadow of the Tomb Raider, Cyberpunk 2077) наиболее сильно нагружала одновременно и графику, и процессор action-adventure про Лару Крофт. Этот проект предъявляет серьезные требования к обоим типам процессоров. В результате тестовые стенды нагружались следующим ПО:

  • Shadow of the Tomb Raider. Тайный город. DirectX 12. Разрешение Full HD, максимальное качество графики.
  • «Ведьмак-3: Дикая охота» (Новиград и окрестности. DirectX 11. Разрешение Ultra HD, максимальное качество графики) + Prime95 30.6 (тест Small FFT).

Помимо тестирования в Shadow of the Tomb Raider, была поставлена цель нагрузить систему по максимуму. Ресурсоемкие тесты (например, комплекс бенчмарков PugetBench для приложений Adobe) для этой цели не очень хорошо подходят, так как они либо нагружают центральный процессор, либо видеокарту, а не оба чипа вместе. Признаюсь честно: я не знаю общедоступного софта, способного одновременно нагрузить на 100 % CPU и GPU, а потому было решено воспользоваться проверенным способом в виде одновременного запуска «Ведьмака» вместе с приложением Prime95, используемым нами в основном для стресс-тестирования железа. Использование «Дикой охоты» выбрано не случайно, ведь далеко не все игры работают стабильно при максимальной загрузке центрального процессора. Важно понимать, что такое тестирование в какой-то степени является искусственным, но зато после проведения всех экспериментов можно со 100-процентной уверенностью заявлять о том, что такой-то сборке хватит блока питания с такой-то мощностью.

Период каждого замера мощности составлял 30 минут, но измерение всех параметров проводилось после прогрева чипов и стабилизации тактовых частот. На графиках ниже приведены данные счетчика энергопотребления программы HWiNFO 64 (средний и максимальный уровни). Так же измерение потребления энергии производилось при помощи ваттметра watts up? PRO — несмотря на столь комичное название, устройство подключается к компьютеру и при помощи специального ПО отслеживает его различные параметры. Учтите, что бытовые ваттметры имеют погрешность измерения и, как правило, занижают показатели мощности «из розетки» при средних и больших нагрузках на 1-5 %.

Все четыре стенда были дополнительно разогнаны, причем речь идет об оверклокинге центральных процессоров, видеокарт и оперативной памяти. Кратко настройки частот и напряжений выглядят следующим образом, и подбирались они исходя из возможностей систем охлаждения, а также разгонного потенциала компонентов:

  • Ryzen 5 5600X (@4,8 ГГц, 1,39 В, LLC 4 (@4,5 ГГц в Prime95)) + GeForce RTX 3080 (1855/1325 МГц, PL 109 %) + 32 Гбайт ОЗУ (DDR4-3400, 1,4 В).
  • Core i5-11600K (@5,0 ГГц, +0,1 В в режиме Offset, LLC 4 (@4,8 ГГц в Prime95)) + GeForce RTX 3080 (1855/1325 МГц, PL 109 %) + 32 Гбайт ОЗУ (DDR4-3400, 1,4 В).
  • Ryzen 9 5900X (@4,8 ГГц, 1,325 В, LLC 4 (@4,5 ГГц в Prime95)) + GeForce RTX 3090 (1900/1356 МГц, PL 123 %) + 32 Гбайт ОЗУ (DDR4-3400, 1,4 В).
  • Core i7-11700K (@5,0 ГГц, +0,05 В в режиме Offset, LLC 4 (@4,75 ГГц в Prime95)) + GeForce RTX 3090 (1900/1356 МГц, PL 123 %) + 32 Гбайт ОЗУ (DDR4-3400, 1,4 В).

Напоминаю, что разгон комплектующих — это всегда лотерея. Более подробно на эту темы мы поговорим чуть позже. А пока перейдем к самому главному — результатам тестирования.

Первое, что бросается в глаза при изучении замеров энергопотребления сборок, — это заметная разница в потреблении центральных процессоров у платформ AM4 и LGA1200. Да, чипы Rocket Lake потребляют заметно больше электроэнергии — особенно при включении стресс-теста Prime95 30.6. С другой стороны, разница в энергопотреблении хоть и является существенной, но не достигает сотен ватт — следовательно, к сборкам AMD и Intel можно предъявлять близкие требования и далее я буду ориентироваться на показатели наиболее прожорливых систем.

Так, мы видим, что в Shadow of the Tomb Raider стенд с Core i5-11600K и GeForce RTX 3080 потребляет в пике чуть меньше 500 Вт. В среднем, по данным программного мониторинга, чип Intel был загружен на 76 %. Как уже было сказано ранее, многие игры потребляют меньше электроэнергии, но не стоит забывать и про будущие проекты — с учетом развития компьютерной техники времена, когда 6-ядерники будут загружены на 100 % даже в играх, настанут довольно быстро.

В летних вариантах продвинутой сборки рекомендовался блок питания мощностью 650 Вт — это на 30 % больше, чем потребляет сборка с Core i5-11600K и GeForce RTX 3080 в SotTR и большинстве других игр. Так что такого БП будет достаточно, если мы говорим  исключительнооб игровой системе. Очевидно, что сборкам с менее производительными видеокартами (Radeon RX 6700 XT, GeForce RTX 3060 и так далее) блока мощностью 600-650 Вт хватит с запасом. И я опять агитирую вас вложиться в качественное устройство.

Далее важно сделать две оговорки. Во-первых, речь идет о качественных блоках питания, которые рекомендуются в продвинутой и максимальной сборках «Компьютера месяца». То есть модель с заявленной мощностью в 650 Вт действительно держит ее при нагрузке на линию 12 В. К тому же даже в режиме «Ведьмак + Prime95» энергопотребление всего стенда не перевалило за отметку в 600 Вт. Но, во-вторых, я не вижу ничего зазорного в том, чтобы использовать даже для продвинутой сборки блок питания блок питания с заметно большим запасом мощности. В таком режиме работы устройство меньше греется и шумит. Плюс разница в цене между моделями пограничной мощности (например, 650 и 750 Вт) в большинстве случаев оказывается незначительной. Эти факты были рассмотрены в статье «Какой блок питания необходим современному игровому ПК».

Если вы надумали купить видеокарту с энергопотреблением под 300 Вт, и у вас уже есть хороший блок питания мощностью 600+ Вт, то не спешите его менять. Скорее всего, проблем вы не испытаете. Я говорю «скорее всего», подразумевая, что несовместимость того или иного БП с мощной видеокартой все же может быть. Она может быть связана не с нехваткой мощности, а с включением встроенной защиты, так как устройство слишком чувствительно реагируют на серьезное увеличение мощности системы. Так, в моем парке есть один очень качественный, но откровенно старенький БП мощностью 1500 Вт, который постоянно вырубается при подключении некоторых моделей GeForce RTX 3080 и GeForce RTX 3090. С другими же версиями этих видеокарт проблем у данного БП нет, а это значит, что описаный случай — частный.

В разгоне сборка с Core i5-11600K и GeForce RTX 3080 потребляет ~580 Вт  в Shadow of the Tomb Raider, а при максимальной нагрузке системы — 650 Вт. Комплексный оверклокинг системного блока заметно увеличивает рост его энергопотребления. Этот момент обязательно нужно учитывать, если вы изначально или со временем (как в описанном ранее примере) планируете разгонять свой ПК. И в случае с таким паттерном использования системы рекомендовать блок питания мощностью 650 Вт неправильно. Экономить нельзя! Другое дело, что в «Компьютере месяца» в основном рекомендуются стандартные сборки без применения разгона — потому что оверклокингом железа занимается абсолютное меньшинство пользователей. А те, кто занимаются, сами знают, какой БП им нужен.

Вторым ограничивающим фактором является необходимость в использовании качественных матплат и систем охлаждения. Напомню, что для этой статьи пришлось использовать необслуживаемую СЖО. В результате эффективности работы ARCTIC Liquid Freezer II-420 оказывается достаточно, чтобы удерживать температуру Core i5-11600K в Prime95 при частоте 4,8 ГГц на уровне  96 градусов Цельсия. В Shadow of the Tomb Raider этот 6-ядерник при частоте 5 ГГц нагревается всего до 66 градусов Цельсия (среднее энергопотребление процессора составило 148 Вт). Опять же, очень многое здесь зависит от условий использования вашего системного блока.

Добавлю, что целесообразность разгона современного компьютерного железа вызывает очень и очень много вопросов, но это тема для отдельной статьи.

Ryzen 9 5900X + GeForce RTX 3090 (разгон)

 

Core i5-11600K + GeForce RTX 3080 (номинал)

Ryzen 9 5900X + GeForce RTX 3090 (разгон)

 

Core i5-11600K + GeForce RTX 3080 (номинал)

Ryzen 9 5900X + GeForce RTX 3090 (разгон)

 

Core i5-11600K + GeForce RTX 3080 (номинал)

Ryzen 9 5900X + GeForce RTX 3090 (разгон)

 

Core i7-11700K + GeForce RTX 3090 (разгон)

А вот в максимальной сборке 650-ваттным блоком уже не обойтись. Здесь необходим вариант большей мощности — источники питания от 850 Вт. При комплексном же разгоне нужен киловатник, не меньше. Ничего не поделать, ведь GeForce RTX 3090 в разгоне потребляет почти 500 Вт! Да и 8-ядерный Core i7-11700K в приложениях, использующих AVX-инструкции, способен «съесть» больше 300 Вт.

⇡#Выводы

Если честно, я даже не знаю, как красиво закончить эту статью — уж слишком очевидными оказались результаты тестирования. Да, видеокарты с энергопотреблением 250+ Вт становятся нормой, и когда майнинг-бум закончится, то у многих геймеров появится отличная возможность обзавестись пусть и прожорливым, но очень и очень быстрым игровым ускорителем — в том числе и за счет рынка б/у. В таком случае необходимо заранее убедиться в том, что ваш блок питания потянет такую «ношу». К счастью, качественные источники мощностью 600-700 Вт справятся с работой обновленных сборок в играх. А вот для экстремальных режимов работы ПК и для разгона не поскупитесь на покупку действительно мощного блока питания. К счастью, мы говорим о таком типе устройств, который устаревает крайне мало и способен пережить далеко не один апгрейд.

Выражаем благодарность российским представительствам компаний ASUS и Seasonic, а также компьютерному магазину «Регард» за предоставленное для тестирования оборудование.

Если Вы заметили ошибку — выделите ее мышью и нажмите CTRL+ENTER.

Как пользоваться двухполюсным указателем напряжения. Как правильно пользоваться индикатором напряжения

При проведении любых электромонтажных работ крайне важно выполнять проверку наличия напряжения на объекте. Делается это с помощью специальных индикаторов и указателей. При этом, для каждого вида электрооборудования существует свой способ индикации. Какие типы указателей напряжения предлагает современный рынок, что нужно учитывать при выборе индикатора и для чего использовать конкретное устройство – читайте ниже.

Какие бывают индикаторы напряжения

Для того, чтобы правильно определить напряжение в сети, необходимо знать какие бывают измерители напряжения и где их можно использовать. Все индикаторы напряжения делятся на устройства для выявления высокого напряжения и приборы для использования на низковольтных объектах. Выбор индикатора для контроля над наличием напряжения зависит от типа электрооборудования. Так, для установок с электрическим потенциалом до 1000в применяют индикаторы и указатели низкого напряжения.

Указатели низковольтного напряжения могут быть:

  • Однополюсными;
  • Двухполюсными.

Однополюсный указатель используют для идентификации напряжения только в цепи переменного тока. Принцип действия такого прибора основан на проходимых способностях емкостного тока. Двухполюсный индикатор используют для определения наличия напряжения в цепях и переменного, и постоянного тока. Такое устройство работает по принципу прохождения активного тока.

Указатели высокого напряжения используют для фазировки высоковольтных кабелей и оборудования с электрическим потенциалом выше 1000 вольт.

Чаще всего, такие устройства применяют для отслеживания наличия напряжения на воздушных линиях электропередач. Кроме того, их можно использовать для фазировки (прозвонки) силовых трансформаторов и другого электрооборудования с напряжением переменного тока до 10 кВ.


По типу связи с токопроводящими частями электрооборудования высоковольтный индикатор может быть:

  • Контактный;
  • Бесконтактный;
  • Комбинированный.

Кроме того, указатели напряжения различают по типу индикации. Так, индикация в низковольтных и высоковольтных указателях может быть устроена на основе светового, звукового и свето-звукового сигнала. В некоторых приборах, в качестве основного элемента индикации, может использоваться цифровой экран.

Индикаторы напряжения до 1000 В

Наиболее доступным и простым, а потому и наиболее популярным, указателем напряжения до 1000 В является индикаторная отвертка. Современный рынок электроизмерительного оборудования предлагает широкий ассортимент индикаторных отверток. Самые доступные – однополюсные приборы, оснащенные неоновой лампой и добавочным сопротивлением. Они способны проводить измерения переменного тока напряжением до 500 В.

Чаще всего, однополюсные индикаторы используют для:

  • Проверки вторичных цепей;
  • Определения фазного провода;
  • Правильного подключения электросчетчиков , диммеров и выключателей, ламп, предохранителей и т.д.

Более широкую сферу использования имеет двухполюсный УНН. С помощью такого устройства можно проводить измерения и переменного, и постоянного тока с напряжением до 1000 В.


Благодаря конструкции двухполюсные индикаторы можно использовать для установки наличия или отсутствия такового напряжения между двумя точками электроустановки.

С помощью двухполюсных индикаторов (например, МИН-1) можно также проводить проверку цепи на обрыв. В качестве индикации в таких приборах могут использоваться светодиоды, неоновые лампы. Существуют комбинированные устройства, световая индикация в которых дополнена звуковой. Использование двухполюсных приборов позволяет получить наиболее полную картину о наличии напряжения.

Цифровой индикатор напряжения: для чего он нужен, как выбрать

Самым распространенным цифровым двухполюсным индикатором напряжения является мультиметр. Этот электрический измерительный прибор позволяет определить не только напряжение переменного и постоянного тока в сети, но и его силу и частоту. Пользоваться таким прибором очень просто, поэтому его часто выбирают для решения бытовых задач.


К основным критериям выбора бытового мультиметра относят:

  1. Процент его погрешности. Так, степень погрешности бытового мультиметра должна быть не более 3%. Для профессиональных моделей этот показатель может быть снижен до 0,025%.
  2. Скорость срабатывания прибора. Чем больше выработок может дать прибор в секунду, тем лучше. Качественный мультиметр должен давать от 70 до 300 выборок в секунду.
  3. Класс электробезопасности мультиметра. Выбор мультиметра по классу зависит от того в каких цепях его будут использовать. Так современные мультиметры можно использовать в локальных, внутренних низковольтных и внешних распределительных цепях.
  4. Уровень пожаробезопасности прибора. Современные измерительные устройства должны оснащаться функциями защиты от перегрузок и автоотключением.

Не стоит забывать и про комплектацию прибора. Большинство современных мультиметров оснащаются специальными щупами или токовыми клещами, позволяющими проводить измерения без выпайки элемента из схемы и не нарушая изоляции проводника.

Отдельно выделяют световые индикаторы для установки в электрических распределительных щитах. Такие индикаторы имеют вид автомата, устанавливаются на DIN-рейку, могут использоваться как в однофазных (220 В), так и в трехфазных (380 В) сетях.

В зависимости от возможности подключения фаз автоматы делят на:

  • Индикаторы наличия напряжения на 1 фазу;
  • Индикаторы наличия напряжения на 2 различные фазы;
  • Указатели наличия напряжения в трехфазной сети;
  • Устройства для индикации напряжения в сетях на 12В и 24В.

Кроме того, автоматы делят в зависимости типа фазы. Так, отдельно можно установить автомат с индикатором напряжения на А (L1), В (L2) и С (L3) фазу. При этом, световая индикация будет соответствовать по цвету фазе. Так, например, автомат на А фазу будет иметь световую индикацию желтого цвета. Автоматические индикаторы на 3 фазы будут иметь отдельные световые индикаторы под каждую фазу.

Как выбрать автоматический индикатор напряжения сети

При выборе автомата с индикатором напряжения необходимо обращать внимание на диапазон отображаемых напряжений. Так, устройства на 3 фазы должны определять напряжение в диапазоне от 100 до 415 В. Автоматы на 2 фазы могут определять напряжение в диапазоне от 100 до 300 В. Чем шире диапазон напряжения устройства, тем лучше.


Кроме того, при выборе автоматических выключателей с индикаторами напряжения следует учитывать:

  • Степень погрешности устройства. Стандартные бытовые автоматы с индикацией напряжения должны иметь степень погрешности не более 3%.
  • Степень защиты устройства. Для внутренней установки подойдут устройства с маркировкой IP20.
  • Тип индикации. Простые модели имеют световую индикацию, представленную светодиодной лампой . Более дорогие модели могут иметь 3-х разрядное цифровое табло для отображения значений.
  • Индекс устройства. Простые автоматы обозначаются буквой С. Автоматы с индикацией, чаще всего, имеют маркировки PMT, PH, SVN в зависимости от типа устройства и производителя.

Приобрести автоматы с индикацией можно в специализированных магазинах для электриков или интернет-магазинах. При этом, следует учитывать производителя автомата. Так, наиболее качественными считаются устройства немецкого производства. Среди лучших производителей электроизмерительных приборов можно выделить компанию Hager.

Как работает указатель напряжения (видео)

Индикаторы высокого и низкого напряжения – это наиболее распространенные средства электрозащиты, которые позволяют идентифицировать наличие напряжения на объекте. На сегодня, все индикаторы делятся на низковольтные и высоковольтные. Кроме того, приборы различаются по внешнему виду, диапазону измерений, типу индикации. Выбрать наиболее подходящий индикатор можно, лишь разобравшись в классификации измерительных приборов. А в этом вам помогут представленные выше рекомендации!

2.4.23. Общие технические требования к указателям напряжения до 1000 В изложены в государственном стандарте.

2.4.24. В электроустановках напряжением до 1000 В применяются указатели двух типов: двухполюсные и однополюсные.

Двухполюсные указатели, работающие при протекании активного тока, предназначены для электроустановок переменного и постоянного тока.

Однополюсные указатели, работающие при протекании емкостного тока, предназначены для электроустановок только переменного тока.

Применение двухполюсных указателей является предпочтительным.

Применение контрольных ламп для проверки отсутствия напряжения не допускается.

2.4.25. Двухполюсные указатели состоят из двух корпусов, выполненных из электроизоляционного материала, содержащих элементы, реагирующие на наличие напряжения на контролируемых токоведущих частях, и элементы световой и (или) звуковой индикации. Корпуса соединены между собой гибким проводом длиной не менее 1 м. В местах вводов в корпуса соединительный провод должен иметь амортизационные втулки или утолщенную изоляцию.

Размеры корпусов не нормируются, определяются удобством пользования.

Каждый корпус двухполюсного указателя должен иметь жестко закрепленный электрод-наконечник, длина неизолированной части которого не должна превышать 7 мм, кроме указателей для воздушных линий, у которых длина неизолированной части электродов-наконечников определяется техническими условиями.

2.4.26. Однополюсный указатель имеет один корпус, выполненный из электроизоляционного материала, в котором размещены все элементы указателя. Кроме электрода-наконечника, соответствующего требованиям п. 2. 4.25, на торцевой или боковой части корпуса должен быть электрод для контакта с рукой оператора.

Размеры корпуса не нормируются, определяются удобством пользования.

Индикация наличия напряжения может быть ступенчатой, подаваться в виде цифрового сигнала и т.п.

Световой и звуковой сигналы могут быть непрерывными или прерывистыми и должны быть надежно распознаваемыми.

Для указателей с импульсным сигналом напряжением индикации является напряжение, при котором интервал между импульсами не превышает 1,0 с.

2.4.28. Указатели напряжения до 1000 В могут выполнять также дополнительные функции: проверка целостности электрических цепей, определение фазного провода, определение полярности в цепях постоянного тока и т.д. При этом указатели не должны содержать коммутационных элементов, предназначенных для переключения режимов работы.

Расширение функциональных возможностей указателя не должно снижать безопасности проведения операций по определению наличия или отсутствия напряжения.

2.4.34. При проверке отсутствия напряжения время непосредственного контакта указателя с контролируемыми токоведущими частями должно быть не менее 5 с.

Указатели напряжения – переносные приборы, предназначенные для проверки наличия или отсутствия напряжения на токоведущих частях. Такая проверка необходима, например, при работе непосредственно на отключенных токоведущих частях, при контроле исправности электроустановок, отыскании повреждений в электроустановке, проверке электрической схемы и т.п.

Во всех этих случаях требуется установить лишь наличие или отсутствие напряжения, но не его значение, которое, как правило, известно.

Все указатели имеют световой сигнал, загорание которого свидетельствует о наличии напряжения на проверяемой части или между проверяемыми частями. Указатели бывают для электроустановок до 1000 В и выше.

Указатели, предназначенные для электроустановок до 1000 В, делятся на двухполюсные и однополюсные.

Двухполюсные указатели требуют прикосновения к двум частям электроустановки, между которыми необходимо определить наличие или отсутствие напряжения. Принцип их действия – свечение неоновой лампочки или лампы накаливания (мощностью не более 10 Вт) при протекании через нее тока, обусловленного разностью потенциалов между двумя частями электрической установки, к которым прикасается указатель. Потребляя малый ток – от долей до нескольких миллиампер, лампа обеспечивает устойчивый и четкий световой сигнал, излучая оранжево-красный свет.

После возникновения разряда ток в цепи лампы постепенно увеличивается, т.е. сопротивление лампы как бы уменьшается, что в конце концов приводит к выходу лампы из строя. Для ограничения тока до нормального значения последовательно с лампой включается резистор.

Двухполюсные указатели могут применяться в установках как переменного, так и постоянного тока. Однако при переменном токе металлические части указателя – цоколь лампы, провод, щуп могут создать емкость относительно земли или других фаз электроустановки, достаточную для того, чтобы при касании к фазе лишь одного щупа указатель с неоновой лампочкой светился. Чтобы исключить это явление, схему дополняют шунтирующим резистором, шунтирующим неоновую лампочку и обладающим сопротивлением, равным добавочному резистору.

Однополюсные указатели требуют прикосновения лишь к одной – испытуемой токоведущей части. Связь с землей обеспечивается через тело человека, который пальцем руки создает контакт с цепью указателя. При этом ток не превышает 0,3 мА.

Изготовляются однополюсные указатели обычно в виде автоматической ручки, в корпусе которой, выполненном из изоляционного материала и имеющем смотровое отверстие, размещены сигнальная лампочка и резистор; на нижнем конце корпуса укреплен металлический щуп, а на верхнем – плоский металлический контакт, которого пальцем касается оператор.

Однополюсный указатель может применяться только в установках переменного тока, поскольку при постоянном токе его лампочка не горит и при наличии напряжения. Его рекомендуется применять при проверке схем вторичной коммутации, определении фазного провода в электросчетчиках, ламповых патронах, выключателях, предохранителях и т. п.

При пользовании указателями напряжения до 1000 В можно обходиться без защитных средств.

Правила техники безопасности запрещают применять вместо указателя напряжения так называемую контрольную лампу – лампу накаливания, ввернутую в патрон, заряженный двумя короткими проводами. Это запрещение вызвано тем, что при случайном включении лампы на напряжение большее, чем она рассчитана, или при ударе о твердый предмет возможен взрыв ее колбы и, как следствие, ранение оператора.

Указатели для электроустановок напряжением выше 1000 В, называемые также указателями высокого напряжения (УВН), действуют по принципу свечения неоновой лампочки при протекании через нее емкостного тока, т.е. зарядного тока конденсатора, включенного последовательно с лампочкой. Эти указатели пригодны лишь для установок переменного тока и приближать их надо только к одной фазе.

Конструкции указателей различны, однако всегда УВН имеют три основные части: рабочую, состоящую из корпуса, сигнальной лампы, конденсатора и пр, изолирующую, обеспечивающую изоляцию оператора от токоведущих частей и изготовляемую из изоляционных материалов, рукоятку, предназначенную для удержания указателя.

При пользовании УВН необходимо применять диэлектрические перчатки. Каждый раз перед применением УВН необходимо произвести наружный осмотр его, чтобы убедиться в отсутствии внешних повреждений и проверить исправность его действия, т.е. способность подавать сигнал.

Такая проверка производится путем приближения щупа указателя к токоведущим частям электроустановки, заведомо находящимся под напряжением. Проверка исправности может производиться и с помощью специальных источников высокого напряжения, а также с помощью мегомметра и, наконец, путем приближения щупа указателя к свече зажигания работающего двигателя автомобиля или мотоцикла.

Запрещается заземлять указатели, поскольку они и без заземления обеспечивают достаточно четкий сигнал, к тому же заземляющий провод может, прикоснувшись к токоведущим частям, явиться причиной несчастного случая.

В отдельных ситуациях, когда емкость указателя относительно заземленных предметов оказывается весьма малой (например, при работах на деревянных опорах воздушных линий электропередачи), указатель напряжения должен быть заземлен.

Для начала монтажных или ремонтных работ на электрических станциях и проводах нужно обязательно проверить показатели сети, отсутствие тока или его параметры. Для этого используется указатель напряжения, который может определить наличие вольтажа и его совпадения до 1000в.

Описание и принцип работы

Указатель высокого напряжения и низкого – это универсальный прибор переносного типа, предназначенный для определения напряжения на токоведущих проводах или клеммах отдельных электрических устройств (УВН 10, УНК, УВНК-10, BN-020022 Profipol Benning и прочие).

Данное приспособление необходимо при работе на различных предприятиях или выезде электромонтажников на объект. Главным отличием этого указателя от стандартных измерителей является то, что он поможет определить только наличие нагрузки, но не её показатели, в отличие от моделей, которые устанавливаются на дин-рейку.

Фото – индикатор с цифровым дисплеем

В основном сейчас используются только устройства напряжения до 1000 Вольт, такой указатель может быть двухполюсный и однополюсный, у них схожая схема, но разные области применения. Во время работы устройства с двумя полюсами нужно подключать к двум токоведущим жилам или контактам, в то время как однополюсный только к одной. Следует знать, что двухполюсные указатели более точные, поэтому они называются высоковольтные и применяются во время сложных работ.

Фото – УН ПИН-90

Помимо этого также есть бесконтактный указатель. Проверка с его помощью проводится без подключения к токоведущим клеммам. Это значительно увеличивает безопасность во время определения напряжения. Устройство оснащено цифровой индикацией, причем на ней отмечается не только наличие вольтажа, но и приблизительный размер благодаря магнитному полю.

Фото – однополюсная модель

Бывают переносные модели на батарейках и варианты, требующие подключения к сети (например, указатель или индикатор напряжения типа Контакт 55ЭМ, УВНУ-10 кВ СЗИП, ЭЛИН-1-СЗ ВЛ). В первом случае питание осуществляется при помощи двух или более батареек, реже от аккумулятора (это УВНК, УННО, УНК, ЭИ-9000/1, Duspol digital LC, Ратон). Это позволяет использовать прибор на местности, при выезде или на ремонтных работах вдали от рабочей сети электропитания.


Фото – импортный УН DT-9902

Принцип работы прибора довольно простой. Во время подключения к сети (при помощи соединения с токоведущими частями) производится сравнение потенциалов. Это повышает или понижает сопротивление в резисторах указателя. Из-за этого индикатор, который потребляет самые малые доли ампер, протекающих в проводах или клеммах, загорается либо издает звуковой сигнал. Если при работе индикатор молчит – то нагрузки нет. В отдельных случаях наблюдается планомерное затухание сигнала – это значит, что в проводах была остаточная энергия.

Требования к указателям напряжения ГОСТ 20493-2001:

  1. У приборов до 1000 Вольт обязательно нагрузка индикаторов должно быть не выше 90 В;
  2. Однополюсное устройство находится в одном корпусе, в то время как двухполюсное располагается в двух, соединенных между собой шнуром;
  3. Любой указатель наличия нагрузки (бортовой, комби и прочие) должны иметь три поверхности: рабочую, изолированную, определяющую и держатель;
  4. В отдельных моделях рабочая часть соединяется с индикатором;
  5. Поверка указателей производится каждый раз перед использованием при помощи напряжения 2 кВ, при этом она длиться не более минуты.

Нужно помнить, что инструкция по безопасности требует полной подготовки перед использованием аппарата. В частности, необходимо надеть энергокомплект, включающий диэлектрические перчатки и ботинки. Эти требования указаны для электрического прибора, и они отличаются от моделей индикаторов в УАЗ, ВАЗ и прочих авто, судов и т. д.

Видео: UT 15В индикатор напряжения

Технические характеристики

Указатели напряжения для фазировки обязательно имеют сертифицированные параметры качества. Они зависят от конкретной модели прибора, рассмотрим данные на примере УННУ-40-1000:

Двухполюсный указатель рабочего напряжения типа УНН Комби имеет параметры аналогичные УННДП 12 660 (кроме максимального напряжения 660 В и рабочих температур до +35):


Фото – УНН Комби

Схожие технические характеристики имеет двухполюсный указатель напряжения УНН 1, ПИН 90, УНК 04, Лоцман-2 и УВНИ 150 А. Их паспорт качества отличается лишь по данным нагрузки и сроку эксплуатации.


Фото – УН Лоцман-2

Параметры однополюсного УВН 80:

Технические данные однополюсного УВНБУ 6–35:

Очень интересная модель УНВЛ-0,4 используется в основном на воздушных линиях электропередач. У него следующие параметры:

Помимо этого, все модели имеют гарантию год, но только при условии регулярной проверки перед началом работы. При покупке всегда обращайте внимание на наличие данных ГОСТ, сертификата и соответствия качества и возможности проверку перед приобретением. Каждые полгода нужно производить калибровку датчика на специальном оборудовании.

Его особенностью является то, что рабочий контакт выполнен в виде крюка, который цепляется на провод независимо от высоты. Сейчас в продаже есть более новая модель для определения напряжения – это указатель УВНУ-10ФБ Поиск 1, где за крепление контактов на токоведущих частях проводов или машин отвечает штанга. Пользоваться прибором этого типа очень просто – высота регулируется при помощи ручных манипуляций, кроме того, можно зафиксировать длину выдвигающейся части.


Фото – УВНУ-10ФБ Поиск 1

Купить указатель напряжения можно в любом городе в специализированных электрических магазинах, но цена будет зависеть от того, кто производитель и типа прибора. Двухполюсные устройства дороже, чем однополюсники. Стоимость также варьируется от города покупки. Например, в Москве определенный УН может стоить выше, чем в Екатеринбурге или Новосибирске.

Некоторые работы в доме могут выполнять люди без специальной подготовки, не прибегая к услугам профессиональных электриков. Замена розеток, выключателей, ремонт настольных и потолочных светильников не требуют высокой квалификации.

Но, выполняя эти работы, нужно соблюдать правила безопасности, которые требуют проверять отсутствие напряжения на контактах электроприборов перед началом работ.

Однополюсный указатель напряжения – самый простой и доступный каждому прибор, показывающий наличие или отсутствие «фазы». Некоторые модели применяются и для поиска мет обрывов в проводах, шнурах и кабелях. Так как некоторые однополюсные указатели совмещают в себе функцию простенькой отвертки, их называют «индикаторными отвертками», а иногда – просто «индикаторами».

Достоинство индикаторов – для их работы не требуется второго провода. Они используют ток, проходящий от «фазы» к «земле» через указатель и тело человека, соединенные последовательно. Для человека этот ток не представляет опасности. Ему не препятствуют ни сопротивление обуви, ни материал пола, но пользоваться указателем в диэлектрических перчатках нельзя, работать он не будет. На практике были единичные случаи, когда индикаторная отвертка не определила наличие «фазы» в светильнике, если электрик стоял на сухой деревянной стремянке.

Виды указателей напряжения

Индикаторы напряжения бывают:

  • с неоновой лампой;
  • со светодиодами, работающие от батареек;
  • с жидкокристаллическим дисплеем;
  • бесконтактные;
  • многофункциональные.

Указатели с неоновыми лампами – самые дешевые . Их недостатки – малое напряжение зажигания и недостаточная яркость свечения. При ярком освещении их приходится прикрывать рукой, чтобы увидеть, светится ли лампа.


У светодиодных индикаторов порог зажигания меньше. Наличие батарейки позволяет выполнять с их помощью «прозвонку» цепей и использовать указатель, как бесконтактный. Если взяться за жало индикаторной отвертки и поднести ее торец с проводу, находящемуся под напряжением, лампочка загорится. Но, если она не загорится, это не будет доказательством отсутствия напряжения.

Недостаток светодиодных указателей – они светятся от наводок в проверяемой цепи, показывая «фазу» там, где ее нет.

Общий недостаток неоновых и светодиодных указателей – наличие пружинки, которая со временем ослабевает. Контакт внутри индикатора нарушается, и он перестает работать.

Этого недостатка лишены индикаторы с дисплеями и бесконтактные указатели напряжения. У индикаторов с дисплеями та же чувствительность, что и у светодиодных. Но они распознают наводки в цепях, указывая на дисплее значение напряжения ниже, чем 220В. Зато их показания не видно в темноте.

Бесконтактные указатели работают от батареек. Если их включить и поднести к фазному проводнику, они издают световой и звуковой сигналы. Это удобно при проверке полного отсутствия напряжения, но неприменимо в случаях определения «фазы» на проводниках, находящихся близко друг к другу. Для этого нужен контактный указатель.

Многофункциональные индикаторы представляют собой мультиметр, совмещающий функции омметра, вольтметра и бесконтактного указателя.

Каждый из указателей имеет недостатки и достоинства. Выбирая индикатор напряжения для собственных нужд, помните: хороший указатель – это тот, которым Вы. Главное – научиться верно понимать сигналы указателя.

Как пользоваться указателем напряжения?

Каждый раз перед началом работы с индикатором напряжения надо:

  • осмотреть прибор, убедиться в целостности корпуса;
  • прикоснуться к «фазе» и удостовериться, что прибор показывает ее наличие.
  • после проверки отсутствия напряжения в месте работы нужно повторить проверку исправности .

Такая последовательность действий указателя в ходе проверки. Ее придерживаются и профессиональные электрики при работе в промышленных электроустановках.

Не забывайте специального контакта на корпусе прибора при проверке. Иначе указатель работать не будет.

Дальний красный гибридный индикатор напряжения, активированный биоортогональной инженерией родопсина на живых нейронах.

  • 1.

    Xu, Y. X., Zou, P. & Cohen, A. E. Отображение напряжения с помощью генетически закодированных индикаторов. Curr. Opin. Chem. Биол. 39 , 1–10 (2017).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 2.

    Gong, Y. Y. et al. Высокоскоростная регистрация нервных импульсов у бодрствующих мышей и мух с помощью флуоресцентного датчика напряжения. Наука 350 , 1361–1366 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 3.

    Kannan, M. et al. Быстрая визуализация напряжения in vivo с использованием красного флуоресцентного индикатора. Nat. Методы 15 , 1108–1116 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 4.

    Jin, L. et al. Потенциалы одиночного действия и подпороговые электрические события, отображаемые в нейронах с помощью флуоресцентного белкового датчика напряжения. Нейрон 75 , 779–785 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 5.

    Платиса, Дж., Васан, Г., Янг, А. и Пиерибон, В. А. Направленная эволюция ключевых остатков флуоресцентного белка меняет полярность чувствительности к напряжению в генетически кодируемом индикаторе ArcLight. ACS Chem. Neurosci. 8 , 513–523 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 6.

    St-Pierre, F. et al. Высокоточная оптическая регистрация электрической активности нейронов с помощью сверхбыстрого флуоресцентного датчика напряжения. Nat. Neurosci. 17 , 884–889 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 7.

    Abdelfattah, A. S. et al. Яркий и быстрый красный флуоресцентный индикатор напряжения белка, который сообщает об активности нейронов в органотипических срезах мозга. J. Neurosci. 38 , 3147–3148 (2018).

    Google ученый

  • 8.

    Yang, H.H. et al. Субклеточная визуализация напряжения и сигналов кальция показывает нейронную обработку in vivo. Cell 166 , 245–257 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 9.

    Хоу, Дж. Х., Краль, Дж. М., Дуглас, А. Д., Энгерт, Ф. и Коэн, А.E. Одновременное картирование мембранного напряжения и кальция в сердце рыбок данио in vivo выявляет специфичные для камер переходы в развитии ионных токов. Фронт. Physiol. 5 , 344 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 10.

    Hochbaum, D. R. et al. Полностью оптическая электрофизиология нейронов млекопитающих с использованием инженерных микробных родопсинов. Nat. Методы 11 , 825–833 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 11.

    Fan, L. Z. et al. Полностью оптическая синаптическая электрофизиология исследует механизм растормаживания, вызванного кетамином. Nat. Методы 15 , 823–831 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 12.

    Adam, Y. et al. Визуализация напряжения и оптогенетика выявляют поведенческие изменения в динамике гиппокампа. Nature 569 , 413–417 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 13.

    Flytzanis, N.C. et al. Варианты архаэродопсина с повышенной чувствительностью к напряжению флуоресценции в нейронах млекопитающих и Caenorhabditis elegans . Nat. Commun. 5 , 4894 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 14.

    Пяткевич К.Д. и соавт. Роботизированный подход многомерной направленной эволюции, применяемый к флуоресцентным репортерам напряжения. Nat. Chem. Биол. 14 , 352–360 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 15.

    Zou, P. et al. Яркие и быстрые разноцветные репортеры напряжения через электрохромный FRET. Nat. Commun. 5 , 4625 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 16.

    Оуэн, С. Ф., Лю, М. Х. и Крейцер, А. С. Температурные ограничения на оптогенетические манипуляции in vivo. Nat. Neurosci. 22 , 1061–1065 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 17.

    Huang, Y. L., Walker, A. S. & Miller, E. W. Фотостабильная кремниевая родаминовая платформа для оптического измерения напряжения. J. Am. Chem. Soc. 137 , 10767–10776 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 18.

    Флулер, Э., Бернхэм, В. Г. и Лоу, Л. М. Спектры, связывание с мембраной и потенциометрические ответы новых зондов сдвига заряда. Биохимия 24 , 5749–5755 (1985).

    CAS PubMed Google ученый

  • 19.

    Treger, J. S., Priest, M. F., Iezzi, R. & Bezanilla, F.Визуализация электрических сигналов в реальном времени с помощью инфракрасного красителя, одобренного FDA. Biophys. J. 107 , L9 – L12 (2014).

    Google ученый

  • 20.

    Ян П. и др. Палитра фторированных потенциочувствительных гемицианиновых красителей. Proc. Natl Acad. Sci. США 109 , 20443–20448 (2012).

    CAS PubMed Google ученый

  • 21.

    Гренье, В., Уокер, А. С. и Миллер, Э. У. Низкомолекулярный фотоактивируемый оптический датчик трансмембранного потенциала. J. Am. Chem. Soc. 137 , 10894–10897 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 22.

    Лю П., Гренье В., Хонг В., Мюллер В. Р. и Миллер Е. В. Флуорогенное нацеливание чувствительных к напряжению красителей на нейроны. J. Am. Chem. Soc. 139 , 17334–17340 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 23.

    Гренье, В., Доус, Б. Р., Лю, П., Миллер, Э. У. Шпионаж за потенциалом мембраны нейронов с помощью генетически определяемых индикаторов напряжения. J. Am. Chem. Soc. 141 , 1349–1358 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 24.

    Абдельфаттах, А.S. et al. Яркие и фотостабильные хемогенетические индикаторы для расширенной визуализации напряжения in vivo. Наука 365 , 699–704 (2019).

    CAS PubMed Google ученый

  • 25.

    Uttamapinant, C. et al. Быстрая, совместимая с клетками химия щелчков с хелатирующими медь азидами для биомолекулярного мечения. Angew. Chem. Int. Эд. 51 , 5852–5856 (2012).

    CAS Google ученый

  • 26.

    Yao, J. Z. et al. Нацеливание флуорофора на клеточные белки посредством ферментно-опосредованного азидного лигирования и штамм-индуцированного циклоприсоединения. J. Am. Chem. Soc. 134 , 3720–3728 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 27.

    Liu, D. S. et al. Циклоприсоединение Дильса-Альдера для нацеливания флуорофора на специфические белки внутри живых клеток. J. Am. Chem. Soc. 134 , 792–795 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 28.

    Xu, Y. et al. Гибридные индикаторы для быстрого и точного отображения напряжения. Angew. Chem. Int. Эд. 57 , 3949–3953 (2018).

    CAS Google ученый

  • 29.

    Debets, M. F. et al. Биоконъюгация с напряженными алкенами и алкинами. В соотв. Chem. Res. 44 , 805–815 (2011).

    CAS PubMed Google ученый

  • 30.

    Lukinavicius, G. et al. Флуорофор в ближнем инфракрасном диапазоне для микроскопии клеточных белков со сверхвысоким разрешением живых клеток. Nat. Chem. 5 , 132–139 (2013).

    CAS PubMed Google ученый

  • 31.

    Nikic, I. et al. Минимальные метки для быстрой двухцветной маркировки живых клеток и микроскопии сверхвысокого разрешения. Angew. Chem. Int. Эд. 53 , 2245–2249 (2014).

    CAS Google ученый

  • 32.

    Никич И., Канг Дж. Х., Жирона Г. Э., Арамбуру И. В. и Лемке Е. А. Мечение белков на живых клетках млекопитающих с использованием химии щелчков. Nat. Protoc. 10 , 780–791 (2015).

    CAS PubMed Google ученый

  • 33.

    Белиу, Г.и другие. Биоортогональное мечение тетразиновыми красителями для микроскопии сверхвысокого разрешения. Commun. Биол. 2 , 261 (2019).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 34.

    Верстейген, Р. М., Россин, Р., тен Хов, В., Янссен, Х. М. и Робиллард, М. С. Щелкните, чтобы высвободить: мгновенное удаление доксорубицина после лигирования тетразином. Angew. Chem. Int. Эд. 52 , 14112–14116 (2013).

    CAS Google ученый

  • 35.

    Ли, Дж., Цзя, С. и Чен, П. Р. Реакция Дильса – Альдера, запускаемая биоортогональным белком в живых клетках. Nat. Chem. Биол. 10 , 1003–1005 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • 36.

    Fan, X. et al. Оптимизированные производные тетразина для быстрого биоортогонального разложения в живых клетках. Angew. Chem. Int. Эд. 55 , 14046–14050 (2016).

    CAS Google ученый

  • 37.

    Ли Дж. И Чен П. Р. Разработка и применение реакций расщепления связи в биоортогональной химии. Nat. Chem. Биол. 12 , 129–137 (2016).

    CAS PubMed Google ученый

  • 38.

    Карлсон, Дж. К. Т., Микула, Х.И Вайследер, Р. Раскрытие биоортогонального выведения, инициируемого тетразином, позволяет использовать химические средства для сверхбыстрого высвобождения и универсального расщепления. J. Am. Chem. Soc. 140 , 3603–3612 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 39.

    Kralj, J. M., Hochbaum, D. R., Douglass, A. D. & Cohen, A. E. Электрический импульс в Escherichia coli , зондированный флуоресцентным белком, указывающим напряжение. Наука 333 , 345–348 (2011).

    CAS PubMed Google ученый

  • 40.

    Краль, Дж. М., Дуглас, А. Д., Хохбаум, Д. Р., Маклорин, Д. и Коэн, А. Е. Оптическая регистрация потенциалов действия в нейронах млекопитающих с использованием микробного родопсина. Nat. Методы 9 , 90–95 (2012).

    CAS Google ученый

  • 41.

    Maclaurin, D., Venkatachalam, V., Lee, H. & Cohen, A. E. Механизм чувствительной к напряжению флуоресценции в микробном родопсине. Proc. Natl Acad. Sci. США 110 , 5939–5944 (2013).

    CAS PubMed Google ученый

  • 42.

    Муджумдар, Р. Б., Эрнст, Л. А., Муджумдар, С. Р., Льюис, К. Дж. И Вагонер, А. С. Реагенты для мечения цианиновых красителей: сульфоиндоцианиновые сукцинимидиловые эфиры. Биоконъюг.Chem. 4 , 105–111 (1993).

    CAS PubMed Google ученый

  • 43.

    Беннетт М. В. и Зукин Р. С. Электрическая связь и синхронизация нейронов в головном мозге млекопитающих. Neuron 41 , 495–511 (2004).

    CAS PubMed Google ученый

  • 44.

    Dhein, S. Каналы щелевого соединения в сердечно-сосудистой системе: фармакологическая и физиологическая модуляция. Trends Pharmacol. Sci. 19 , 229–241 (1998).

    CAS PubMed Google ученый

  • 45.

    Chow, B. Y. et al. Высокоэффективное генетически нацеленное оптическое нейронное подавление с помощью световых протонных насосов. Природа 463 , 98–102 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 46.

    Кискинис, Э.и другие. Полностью оптическая электрофизиология для высокопроизводительной функциональной характеристики модели БАС, полученной с помощью ИПСК человека. Stem Cell Rep. 10 , 1991–2004 (2018).

    CAS Google ученый

  • 47.

    Xu, Y. et al. Визуализация активности нейронов с помощью быстрых и чувствительных электрохромных индикаторов FRET со смещением в красную область. ACS Chem. Neurosci. 10 , 4768–4775 (2019).

    CAS PubMed Google ученый

  • 48.

    Uttamapinant, C., Sanchez, M. I., Liu, D. S., Yao, J. Z. & Ting, A. Y. Сайт-специфичное мечение белков с использованием PRIME и химии щелчков с помощью хелатирования. Nat. Protoc. 8 , 1620–1634 (2013).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • Amazon.com: Измеритель напряжения постоянного / переменного тока HOLDPEAK HP-41A, Бесконтактный цифровой мультиметр-тестер с кнопочной конструкцией, 2000 отсчетов, макс. / Мин. Для измерения постоянного / переменного тока, сопротивления, Проверка светодиодов, NCV (малый размер ): Все остальное

    Цифровой мультиметр-тестер HOLDPEAK HP-41A с бесконтактным индикатором измерения напряжения переменного тока, 2000 отсчетов, для измерения постоянного / переменного напряжения / тока, сопротивления, проверки светодиодов, NCV (малый размер)

    Заявка:

    Проверка напряжения постоянного и переменного тока: Да

    Проверка постоянного тока: Да

    Тест на сопротивление: Да

    Температурный тест: Да

    Тест батареи: Да

    Диодный тест: Да

    Звуковой тест непрерывности: Да

    Функция:

    ✓ Индикация выхода за пределы диапазона

    ✓ Автоматическое отображение отрицательной полярности

    ✓ Индикация низкого заряда батареи

    ✓ Автоматическое / ручное управление диапазоном.

    ✓Автоматическое отключение питания

    ✓МАКС / МИН

    ✓Удержание данных

    ✓ Задний свет

    ✓ Контрольная лампа непрерывности

    ✓ Световой индикатор бесконтактного переменного напряжения (NCV)

    ✓Удержание данных

    Сверхбыстрая двухфотонная визуализация индикатора напряжения с высоким коэффициентом усиления у бодрствующих мышей

    ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ И ПОДРОБНОСТИ ОБЪЕКТА

    Клеточные линии

    Все клеточные линии поддерживались в увлажненном инкубаторе при 37 ° C с 5% CO 2.Для электрического скрининга ранее описанная линия клеток HEK293-Kir2.1 (Zhang et al., 2009) была дополнительно субклонирована для достижения более постоянного мембранного потенциала покоя приблизительно -75 мВ и поддерживалась в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, 5%. FBS, 2 мМ глутамина и 400 мкг / мл генетицина (Life Technologies). Для регистрации патч-кламп клетки HEK293A культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с высоким содержанием глюкозы (DMEM, Life Technologies) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (FBS, Life Technologies) и 2 мМ глутамина (Sigma-Aldrich).Для характеристики кинетики ASAP при физиологических температурах клетки CHO-K1 культивировали в среде DMEM / F12 с 10% FBS.

    Первичная клеточная культура

    Нейроны гиппокампа выделяли из эмбрионов крыс Sprague Dawley обоих полов на 18-й день. Процедуры проводились в соответствии с правилами Административной группы Стэнфордского университета по уходу за лабораторными животными

    Вирусы

    AAV1.hSyn.Cre (1,9 × 10 13 ) и AAV1.CamKII.Cre (4,49 × 10 13 ). ) были получены из Penn Vector Core.AAV9.CAG.Flex.ASAP3-Kv.WPRE.SV40pA (2,05 × 10 13 ), AAV1 .CAG.Flex.ASAP3-Kv.WPRE.SV40pA (2,10 × 10 13 ), AAV9. hSyn.Flex. ASAP2s-Kv.WPRE.SV40pA (2,3 × 10 13 ) и AAV9.hSyn.Flex.ASAP3-Kv.WPRE.bGHpA (3,95 × 10 13 ) были произведены Стэнфордским центром нейробиологии по генному вектору и вирусному ядру. AAV1. EF1α.FLEx.ASAP3-Kv.WPRE.bGHpA (2,04 × 10 13 ), AAV1.EF1α.FLEx.ASAP3-Kv.bGHpA, AAV1.EF1α.ASAP3-bGHpA (оба 3,48 × 10 12 ) и AAV1.Все cKit :: Cre.bGHpA (2,23 × 10 12 ) были клонированы и произведены в IBENS. Все титры указаны в копиях генома (ГХ) на мл.

    Животные

    Для экспериментов на срезе и in vivo использовали самцов мышей C57BL / 6 дикого типа и мышей смешанного пола PV :: Cre (Hippenmeyer et al., 2005). Всех мышей содержали в стандартных условиях (до пяти животных в клетке, 12-часовой цикл свет / темнота с включением света в 7 часов утра, с водой и кормом ad libitum). Эмбрионы крыс Sprague Dawley на 18-й день использовали в качестве ткани гиппокампа для культивирования нейронов.Все протоколы соответствовали руководящим принципам отчета Французского национального комитета по этике науки и здравоохранения «Этические принципы экспериментов на животных» в соответствии с Директивой Европейского сообщества 86/609 / EEC согласно соглашению № 12007 или были одобрены Стэнфордским институтом животных. Комитет по использованию и уходу.

    ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ МЕТОДА

    Конструирование плазмиды

    Плазмиды получали стандартными методами молекулярной биологии со всеми клонированными фрагментами, подтвержденными секвенированием.Субклонированные в pcDNA3.1 ASAP2 послужили отправной точкой для создания библиотеки на основе ПЦР. Для характеристики in vitro в клетках HEK293A все варианты ASAP и Arclight Q239 были субклонированы в векторе pcDNA3.1 / Puro-CAG (Lam et al., 2012) между сайтами NheI и HindIII. Для определения in vitro в культивируемых нейронах и экспериментов с острым полосатым телом варианты ASAP экспрессировали из плазмид, упаковывающих аденоассоциированный вирус (AAV), под контролем промотора синапсина человека (hSyn).Для кинетической характеристики в клетках CHO-K1 и нацеливания на сомы в кортикальных срезах ASAP экспрессировали из Cre-зависимых кассет с перевернутым вырезом (FLEx) ниже промотора EF1α. Для экспериментов на органотипических срезах гиппокампа конструкции ASAP доставляли в клетки в векторных плазмидах pcDNA3. 1 / Puro-CAG. Для экспериментов с острым полосатым телом и мышами версия сенсора, нацеленная на сомы, ASAP3-Kv, была создана путем слияния с С-концом ASAP3 линкера последовательности GSSGSSGSS, за которым следует проксимальный рестрикционный 65-аминокислотный сигнал и сигнал кластеризации от С-концевой цитоплазматический сегмент Kv2.1 калиевый канал (Lim et al., 2000), который использовался для ограничения опсинов (Baker et al., 2016; Wu et al., 2013) и ASAP2 (Daigle et al., 2018) сома и проксимальных дендритов . Затем ASAP3-Kv был субклонирован в pAAV.hSyn.WPRE (используемый в экспериментах с острыми срезами) и pAAV.CAG.FLEx.WPRE (используемый в экспериментах на мышах), и полученные плазмиды были использованы для создания частиц AAV в векторе гена Neuroscience и Вирусное ядро ​​Стэнфордского университета. Для экспрессии ASAP, управляемой EF1α, вирусные конструкции были созданы путем модификации опубликованных методов (White et al., 2011) с использованием рекомбинации GateWay и сборки Гибсона и производятся в IBENS, как описано ранее (Zolotukhin et al. , 1999). Для экспрессии Cre, управляемой c-Kit, была создана конструкция промотора, имеющая открытую рамку считывания Cre и последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (bGHpA), вставленную в стартовый кодон геномной последовательности c-Kit мыши (Cairns et al. , 2003), так что было 667 пар оснований (п.н.) передних фланкирующих последовательностей и 1805 п.н. нижестоящих фланкирующих последовательностей c-Kit.

    Разработка основанного на электропорации скрининга в клетках млекопитающих

    Высокопроизводительный скрининг ускорил разработку других классов индикаторов нейрональной активности и, по-видимому, может также способствовать развитию GEVI. Однако высокопроизводительный скрининг на GEVI затруднен, поскольку существующие методы изменения мембранного потенциала были громоздкими, ненадежными или медленными. Электроды с коммутационным зажимом могут вызывать точные изменения трансмембранного напряжения, но не обеспечивают высокую производительность или автоматизацию. Внешние электроды также могут вызывать изменения напряжения и использовались для улучшения QuasArs, FlicR1 и Mermaid D129E (Abdelfattah et al., 2016; Hochbaum et al., 2014; Piatkevich et al., 2018; Platisa et al., 2017; Tsutsui et al., 2014), но индуцированные потенциалы на мембране зависят от клеточной морфологии и местного внеклеточного окружения и, таким образом, изменчивы (Pucihar et al., 2009). AP возникают спонтанно в культивируемых нейронах, но культура нейронов и трансфекция ненадежны, а AP нейронов различаются по ширине, высоте, частоте и продолжительности предшествующих событий медленной деполяризации (Siebler et al., 1993). Клетки HEK293, стабильно экспрессирующие калиевые и натриевые каналы, спонтанно генерируют AP с равномерным временем нарастания (Park et al., 2013) и использовались для разработки вариантов Arch и ArcLight (Park et al., 2013; Platisa et al., 2017), но кинетические различия между разными индикаторами, которые можно различить с помощью электрофизиологии патч-зажим (например, Arch против ArcLight), нельзя разрешить по оптическим ответам в этих клетках (Park et al., 2013). Короче говоря, существующие методы управления мембранным напряжением не являются простыми, надежными или достаточно быстрыми для высокопроизводительного скрининга GEVI с быстрой кинетикой.

    Чтобы определить, можно ли использовать электропорацию для изменения напряжения для скрининга GEVI, мы протестировали различные длительности импульсов и напряжения при визуализации ASAP1. С импульсами 20 В длительностью 2 мс мы наблюдали быстрое переходное изменение флуоресценции ASAP1, достигающее пика ~ 70 мс после импульса, за которым следовало медленное затухание. Направление быстрого переходного процесса зависело от ориентации выводов (Рисунок S1b). С катодом в ванне и заземлением, подключенным к поверхности, ответом было усиление флуоресценции, противоположное тому, что ожидается от деполяризации.Поскольку кинетика импульса имеет тот же временной масштаб, что и кинетика ASAP1 (~ 2 мс), этот результат можно объяснить тем, что ASAP1 реагирует непосредственно на приложенное поле с последующей релаксацией до нейтрального состояния после импульса, если большая часть сигнала ASAP1 возникла из верхней части ячеек. Если бы наблюдаемые нами отклики были вызваны тем, что ASAP1 непосредственно воспринимал приложенное поле, можно было бы ожидать, что импульс с длительностью намного короче, чем кинетика отклика индикатора, не сможет вызвать прямой отклик индикатора, позволяя индикатору реагировать только на любая последующая необратимая потеря трансмембранного потенциала из-за электропорации.Действительно, более медленный GEVI, ArcLight, который реагирует на напряжение в том же направлении, что и ASAP1, не показал восходящего отклика на импульс 20 В длительностью 2 мс (рис. S1c). Кроме того, временный характер наблюдаемого ответа ArcLight (рисунок S1c) предполагает, что клетки восстанавливаются после электропорации после этих условий, как это происходит в протоколах электропорации плазмиды в прилипшие клетки млекопитающих (для которых 2 мс, 200 В являются типичными условиями).

    Затем мы протестировали более короткие и более сильные электрические импульсы.Когда мы приложили импульс 50 В с длительностью 10 мкс и положительным напряжением в ванне, изменений флуоресценции ASAP1 не наблюдалось (рисунок S1d). Отсутствие какого-либо ответа предполагало, что электропорация не произошла, и что ASAP1 не мог реагировать на поле 50 В длительностью 10 мкс, в отличие от его способности реагировать на поле 20 В длительностью 2 мс. Этот результат согласуется с известной кинетикой активации ASAP1 от 2 до 3 мс, поскольку не ожидается, что ASAP1 непосредственно обнаружит импульс длительностью 10 мкс. Увеличение амплитуды напряжения до 100 или 150 В в импульсе длительностью 10 мкс затем вызывало нисходящую ступенчатую реакцию флуоресценции ASAP1 на ~ 15%, как и ожидалось для постоянной деполяризации при 0 В.Амплитуда ответа не увеличивалась между 100 и 150 В, и не происходило длительного восстановления после импульсов 100 и 150 В, что свидетельствует о перманентной электропорации в обоих этих условиях. Чтобы гарантировать устойчивую постоянную электропорацию, мы выбрали для скрининга импульсный режим 10 мкс 150 В. Реакция различных GEVI в этих условиях электропорации хорошо коррелировала с их ответами на скачки напряжения от -70 до 0 мВ в экспериментах с патч-зажимом (рисунок S1e).

    Автоматизированная электропорация, получение изображений и анализ в многолуночных планшетах

    Для ускорения скрининга на основе электропорации в многолуночных планшетах мы написали сценарии в MATLAB 9.0 (Mathworks) для автоматизации получения изображений, перемещения столика микроскопа, позиционирования электродов, подачи импульсов и анализа изображений. Это позволяло проводить скрининг в полуавтоматическом режиме, когда пользователь находил только лучшее поле зрения и настраивал фокус. При пяти секундах получения изображения на лунку почти полный экран библиотеки (из ~ 360 конструкций) обычно завершался в течение пяти часов. Для автоматического анализа изображений полученные изображения были объединены таким образом, чтобы один пиксель примерно покрыл одну ячейку исходного изображения (рис. S2e, f).После вычитания фона пять таких «клеток», которые достигли максимального изменения флуоресценции после импульса, были объединены и использованы для получения среднего отклика датчика для этой лунки (рисунок S2g). Хотя эта автоматизированная обработка снизила измеренную чувствительность флуоресцентных ответов по сравнению с ручным анализом (рис. S2h, i), она успешно различает известные датчики с точки зрения динамического диапазона и кинетики (рис. S2j).

    Оптимизированная процедура электрического скрининга была следующей.Клетки HEK293-Kir2.1 помещали в 384-луночные планшеты (Grace Bio-Labs) на предметные стекла из проводящего стекла, покрытые гидробромидом поли-D-лизина (Sigma-Aldrich). Электропроводность предметных стекол обеспечивается за счет одностороннего покрытия оксидом индия и олова с поверхностным сопротивлением 70–100 Ом (Delta Technologies). Клетки HEK293-Kir2.1 трансфицировали библиотеками, созданными с помощью ПЦР, в 384-луночных планшетах с липофектамином 3000 (~ 100 нг ДНК, 0,4 мкл реагента p3000, 0,4 мкл липофектамина) с последующей заменой среды через 4–12 часов и визуализацию 2 дней после трансфекции.Для функционального скрининга с помощью электропорации мы визуализировали клетки при комнатной температуре на инвертированном микроскопе IX81, оснащенном объективом с числовой апертурой (NA) 20 × 0,75 (Olympus). Источником возбуждающего света служила лампа с короткой дугой на парах ртути (X-Cite 120PC, Exfo) мощностью 120 Вт. Набор фильтровальных кубиков состоял из возбуждающего фильтра 480/40 нм и длиннопроходного эмиссионного фильтра 503 нм. Клетки помещали в 384-луночные планшеты на предметные стекла из проводящего стекла и отображали непосредственно на предметном столике микроскопа в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS), забуференном 10 мМ HEPES (Life Technologies).Если не указано иное, проводящее стеклянное предметное стекло было подключено к клемме заземления стимулятора травы S48 (Astro-Med). Электрическая цепь замыкалась платиновым электродом (диаметром 0,25 мм, Sigma-Aldrich), помещенным в каждую лунку и помещенным на ~ 400 мкм выше монослоя клеток. Изготовленный на заказ держатель, закрепленный вместо конденсора микроскопа, поддерживал узел для перемещения платинового электрода в размере z и его подключение к стимулятору. Скрининг библиотек ASAP проводился на платформе при комнатной температуре в полуавтоматическом режиме, при этом оператор определял наилучшее поле обзора и фокусировался на клетках.Одно поле зрения отображалось в общей сложности в течение 5 с, с прямоугольным импульсом 150 В длительностью 10 мкс, приложенным рядом с отметкой 3 с. Флуоресценция регистрировалась при 100 Гц (экспозиция 10 мс на кадр) ORCA Flash5.0 V2 {“type”: “entrez-nucleotide”, “attrs”: {“text”: “C11440”, “term_id”: ” 1536511 “,” term_text “:” C11440 “}} C11440–22CA CMOS-камера (Hamamatsu) с биннингом пикселей, установленным на 4 × 4.

    Полные комбинаторные библиотеки были проверены не менее трех раз, причем 40 лучших вариантов были дополнительно охарактеризованы вторичный экран на 4–6 скважин на вариант.Если не было вариантов лучше, чем родительский (раунд 2 скрининга), вторичный раунд не проводился. Чтобы выбрать варианты для вторичного скрининга, данные по всем прогонам оценивались так, чтобы каждая конструкция была измерена не менее трех раз на первичных экранах.

    Улучшение ASAP с помощью нескольких раундов структурно-управляемого комбинаторного мутагенеза насыщения

    Сначала мы выполнили комбинаторный мутагенез с насыщением двух последних аминокислот линкера S3-cpGFP (положения 146–147,), клонировав все 400 комбинаций аминокислот и просмотр их в трех экземплярах.Отбирали 40 клонов с наибольшим изменением флуоресценции и повторяли на вторичном скрининге в шести повторах на образец. Три лучшие конструкции (фиг. S3c) были клонированы в плазмиды экспрессии млекопитающих и охарактеризованы в клетках HEK293 по яркости и чувствительности при фиксации напряжения. Хотя улучшения были скромными, ASAP2f L146G S147T R414Q действительно показал немного лучшие реакции на деполяризацию (рисунок S3d, e) и был выбран для дальнейшей эволюции.

    Во втором раунде скрининга мы мутировали Phe-148 и His-151 на все 400 возможных комбинаций аминокислот ().Phe-148 (Phe-145 в GFP) упаковывается против хромофора, но другая боковая цепь в этом положении может быть способна отдавать водородную связь хромофору, возможно, в сочетании с другой боковой цепью в положении 151. Неожиданно большой размер количество мутантов сохранило некоторую чувствительность, при этом многие гидрофобные боковые цепи допустимы в положении 148 и доноры водородных связей допустимы в положении 151. Никакая мутация в положении 148, по-видимому, не улучшала реакцию, в то время как некоторые мутации в положении 151, по-видимому, давали более выраженные ответы (Рисунок S4) .Таким образом, мы решили повторно мутагенизировать ASAP2f L145G S146T R414Q в положении 151, а также мутировать соседнее положение 150, чтобы совместно оптимизировать их вместе в третьем раунде скрининга ().

    В третьем раунде скрининга двойной мутант S150G h251D показал значительно улучшенную чувствительность при электропорации (рис. S5a, b). Фиксация пластыря подтвердила улучшенную чувствительность этого варианта, ASAP2f L146G S147T S150G h251D R414Q, который мы обозначили как ASAP2.5, как на гиперполяризацию, так и на деполяризацию (рис. S5c, d).Интересно, что мутант с одним только h251D (который также был отобран в раунде 2) или мутант с одним только S150G, показал гораздо более низкую чувствительность (рисунок S5e, f), что указывает на важность мутаций в обоих положениях.

    В четвертом раунде скрининга мы мутировали положение 206 на все аминокислоты, поскольку Thr-206 (Thr-203 в GFP) также служит донором Н-связи для хромофора и мутацией этого сайта в ароматическую боковую цепь, такую ​​как поскольку Phe, Tyr и Trp вызывают красное смещение флуоресценции GFP. Однако мы не получили никаких дальнейших улучшений по сравнению с ASAP2.5 (фиг. S6), при этом мутант T206Y не показывает чувствительности к напряжению, а мутанты T206F и T206W не показывают флуоресценции.

    Наконец, в пятом раунде скрининга мы выполнили комбинаторный мутагенез насыщения Phe-148 и Asn-149 в ASAP2.5, так как движения через эти позиции могут быть вовлечены в трансдуцирование конформационных изменений от VSD к Asp-151 в ASAP2. 5. Самый эффективный мутант из этого скрининга (рисунок S7a, b) имел мутацию N149R, сохраняя при этом Phe-148. Зажатие участка показало, что этот мутант был немного более чувствительным, чем ASAP2.5 при гиперполяризации или деполяризации из-за более крутого наклона кривой флуоресценции-напряжение при напряжении мембраны в состоянии покоя (рис. S7c, d). Этот вариант получил обозначение ASAP3.

    Зажим целых клеток и визуализация клеток HEK293A

    Для регистрации клеток HEK293A все варианты ASAP и Arclight Q239 были субклонированы в векторе pcDNA3.1 / Puro-CAG (Lam et al., 2012) между Nhel и Hindlll. сайтов и трансфицировали в 24-луночных планшетах с липофектамином 3000 (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя (400 нг ДНК, 1 мкл реагента P3000, 1 мкл липофектамина).Между 4 и 24 часами после трансфекции клетки повторно высевали при 15-25% конфлюентности на 12-миллиметровые стеклянные покровные стекла № 0 без покрытия (Carolina Biological) и использовали на следующий день (1-2 дня после трансфекции). Эксперименты с патч-зажимом в основном проводились, как описано ранее (Chamberland et al., 2017). Электрические сигналы регистрировали в режиме фиксации напряжения с помощью усилителя Multiclamp 700B и программного обеспечения pClamp (Molecular Devices). Патч-электроды с сопротивлением от 3,5 до 5 МОм вытягивались из боросиликатных капилляров с нитью накала и внутренним / внешним диаметром 1/1.5 мм (стекло King Precision). Клетки HEK293A, редко помещенные на покровные стекла без покрытия, хранили в перфузионной камере на предметном столике инвертированного микроскопа Axiovert 100M (Zeiss) и непрерывно перфузировали внеклеточным раствором (110 мМ NaCl, 26 мМ сахарозы, 23 мМ глюкозы, 5 мМ HEPES-Na, 5 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl 2 , мМ MgSO 4 , pH доведен до 7,4) при комнатной температуре (23 ° C). Пипетки-патчи заполняли 115 мМ глюконатом калия, 10 мМ HEPES-Na, 10 мМ EgTa, 10 мМ глюкозы, 8 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2 и 1 мМ CaCl 2 , pH доводили до 7.4. Флуорофоры освещались при плотности мощности ~ 4,3 мВт / мм 2 в плоскости образца с помощью синего светодиода UHP-Mic-LED-460 (Pryzmatix), пропущенного через возбуждающий фильтр 484/15 нм и сфокусированного на образце через масляно-иммерсионный объектив 40 × 1,3 NA (Zeiss). Испускаемая флуоресценция проходила через эмиссионный фильтр 525/50 нм и регистрировалась камерой устройства электронного умножения с зарядовой связью iXon 860 (Oxford Instruments), охлажденной до -80 ° C. Для всех экспериментов был включен режим передачи кадров, а усиление eM было установлено на 10.Чтобы охарактеризовать ответы стационарной флуоресценции, клетки фиксировали напряжением при удерживающем потенциале -70 мВ, затем вводили шаги напряжения длительностью 500 мс между -120 и 50 мВ. Чтобы получить полные кривые настройки напряжения, были наложены шаги от -180 до +180 мВ. Когда ограничение по напряжению не могло быть применено к некоторым ячейкам при самых высоких потенциалах, этот шаг был исключен из анализа данных. Перед каждым шагом был включен деполяризующий импульс длительностью 10 мс (от -70 до -16 мВ), чтобы упростить обработку изображения и дать возможность грубой оценки кинетики сенсора.Изображения получали с частотой 200 Гц, а флуоресценцию анализировали по периметру клетки. Чтобы охарактеризовать кинетику индикаторов ASAP, изображения были получены с частотой 2,5 кГц из области, обрезанной до 64 × 64 пикселей, и затем объединены в группы, чтобы она составляла всего 8 × 8 пикселей. Флуоресценцию количественно оценивали суммированием сигнала от всех 64 пикселей. Шаги командного напряжения применялись в течение 1 с, и каждая ячейка вносила в среднем два идентичных шага для анализа. Двойная экспоненциальная аппроксимация была применена к интервалу 500 мс после скачка напряжения с использованием программного обеспечения IgorPro (WaveMetrics).Для всех экспериментов следы флуоресценции корректировали на фотообесцвечивание путем деления записанного сигнала на экспоненциальную аппроксимацию данных. Данные были подобраны с использованием двойной экспоненты или одной экспоненты (после исключения начального быстрого фотообесцвечивания). В анализ были включены только клетки HEK293A с сопротивлением доступа ( Ra ) <12 МОм и сопротивлением мембраны (Rm) к соотношению Ra > 20. Формы командных сигналов, наложенные в зажиме напряжения, учитывают потенциал жидкостного перехода.

    Зажим целого участка клетки и визуализация клеток CHO-K1

    Для характеристики кинетики в клетках CHO-K1 экспрессировали ASAP из Cre-зависимых плазмид эксцизии FLEx (pAAV.EF1α.FLEx.ASAP3.bGHpA, pAAV.EF1α.FLEx .ASAP3-Kv.bGHpA или pAAV.hSyn.FLEx.ASAP2s.WPRE) и котрансфицировали плазмидой для экспрессии Cre-рекомбиназы (pBS185 CMV-Cre; AddGene # 11916). Клетки CHO-K1 трансфицировали (Longo et al., 2013) 200 мкл смеси полиэтилин-имина (PEI) и плазмид ДНК и pBS185-CMV-CRE.PEI (25 кДа при 1 мг / мл) смешивали в соотношении 3: 1 (мас. / Мас.) С 1,5 мкг ASAP3 и 0,5 мкг плазмид Cre и добавляли к клеткам через два дня после посева на стерильные стеклянные покровные стекла толщиной 15 мм. в лунку 6-луночного планшета. Запись в режиме пластыря целых клеток выполняли при 22 или 34 ° C через 3-4 дня экспрессии. Внешний раствор представлял собой 140 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 1 мМ CaCl 2 , 10 мМ HEPES pH 7,3. Внутренний раствор представлял собой 10 мМ EGTA, 0,2 мМ CaCl 2 , 110 мМ CsCl, 20 мМ TEA, 10 мМ HEPES, 6 мМ NaCl, 4 мМ АТФ, 0.4 мМ GTP. Записи с фиксацией напряжения из клеток CHO-K1 выполнялись с помощью усилителя Multiclamp 700B, обрабатывались 4-полюсным фильтром Бесселя 10 кГц, а затем оцифровывались на частоте 50 кГц. Компенсация последовательного сопротивления ячеек СНО привела к окончательному последовательному сопротивлению ниже 5 МОм. Флуоресцентную визуализацию выполняли на вертикальном микроскопе BX51 (Olympus), оборудованном платформами и манипуляторами (Scientifica) и камерой Xzyla (Andor). Возбуждение ASAP было получено ограниченным освещением изолированной записанной ячейки с использованием светового механизма SOLA (Lumencor) с фильтрами ET470 / 40X, T495LPXR и ET525 / 50M (Chroma).Сигнал флуоресценции регистрировался фотоэлектронным умножителем PMTSS (Thor Labs) с фильтром нижних частот с частотой 3 кГц и оцифровывался с частотой 50 кГц.

    Первичная культура нейронов и трансфекция

    Нейроны гиппокампа были выделены из эмбрионов крыс Sprague Dawley на 18-й день путем диссоциации в среде RPMI, содержащей 5 единиц / мл папаина (Worthington Biochemical) и 0,005% ДНКазы I при 37 ° C и 5% CO 2 в воздухе. Диссоциированные нейроны высевали с плотностью 3,5 × 10 4 клеток / см 2 в 24-луночные планшеты на промытые 12-мм планшеты No.0 стеклянные покровные стекла, предварительно покрытые на ночь гидробромидом поли-D-лизина> 300 кДа (Sigma-Aldrich). Клетки высевали на несколько часов в нейробазальную среду с 10% FBS, 2 мМ GlutaMAX и добавкой B27 (Life Technologies), затем среду заменяли на Neurobasal с 1% FBS, 2 мМ GlutaMAX и B27. Половину среды заменяли каждые 3-4 дня свежей средой без FBS. 5-Фтор-2′-дезоксиуридин (Sigma-Aldrich) обычно добавляли в конечной концентрации 16 мкМ при 7–9 DIV для ограничения роста глии.Нейроны гиппокампа трансфицировали на 9-11 DIV с использованием модифицированной процедуры трансфекции Lipofectamine 2000 (Life Technologies), в которой среду в одной лунке 24-луночного планшета заменяли на 60–90 мин 200 мкл ДНК-липидных комплексов (100 нг индикаторная ДНК, 400 нг пустого вектора pNCS, 1 мкл липофектамина 2000, 200 мкл нейробазала с 2 мМ GlutaMAX).

    Зажим целыми клетками и визуализация культивируемых нейронов гиппокампа

    Культивированные нейроны гиппокампа крысы трансфицировали, как описано выше, плазмидами, экспрессирующими ASAP, под контролем промотора синапсина человека (hSyn).Затем через 2–4 дня, в 11–14 DIV, выполняли электрофизиологию «патч-зажим». Запись «патч-зажим» выполняли, как указано выше, с клетками HEK293A. Ванны и внутриклеточные растворы были такими же, за исключением того, что гидрат динатриевой соли CNQX (Sigma-Aldrich) был добавлен к внеклеточному раствору в некоторых случаях для выделения вызываемых током AP. Запись в нейроны проводилась в режиме токового зажима без удержания подачи тока. Точки доступа вызывались подачей импульсов тока длительностью 1 мс 700–1100 пА. Программное обеспечение pClamp (Molecular Devices) использовалось для регистрации электродных напряжений, которые были скорректированы с учетом потенциала жидкого перехода post hoc.Изображения были получены с частотой 1 кГц с биннингом 4 × 4, и флуоресценция измерялась для всех пикселей тела клетки. Были проанализированы только нейроны с мембранным потенциалом покоя менее -50 мВ, Ra, менее 17 МОм и Rm , по крайней мере, в 10 раз больше, чем Ra . Для этих ячеек для характеристики ASAP использовались только AP с пиковой амплитудой не менее 0 мВ и шириной менее 5 мс при -20 мВ. От трех до 34 AP было захвачено на нейрон, и их среднее значение (AP на клетку) использовалось для статистики.Следы флуоресценции были скорректированы на фотообесцвечивание и нормализованы к базовому уровню с помощью пользовательских процедур в MATLAB, а затем экспортированы в Excel (Microsoft) для построения графиков. Для Video S1 и ASAP3-экспрессирующие нейроны гиппокампа были отображены в режиме фиксации напряжения с помощью ORCA Flash5.0 V2 {“type”: “entrez-nucleotide”, “attrs”: {“text”: “C11440″, ” term_id “:” 1536511 “,” term_text “:” C11440 “}} C11440–22CA CMOS-камера (Hamamatsu) с частотой 20o Гц. Для анализа sEPSP использовалась функция besself MATLAB для генерации коэффициентов для 6-полюсного фильтра Бесселя с частотой 50 Гц.Затем сгенерировали передаточную функцию с помощью функции tf в MATLAB и применили к сигналу с помощью функции lsim в наборе инструментов системы управления. Эта функция применялась вперед и назад для корректировки сдвигов во времени.

    Оценка яркости и нацеливания сомы в нейронах гиппокампа

    GEVI временно экспрессировались в культивируемых нейронах гиппокампа, как описано выше, и визуализировались через 2 дня при 12 DIV во внеклеточном растворе. FusionRed с С-концевым мотивом фарнезилирования для нацеливания на мембрану ко-экспрессировался из тех же плазмид через внутренний сайт входа в рибосому.Клетки получали на инвертированном микроскопе Axiovert 200M с объективом 20 × 0,75-NA (для оценки яркости) или 40 × 1,2-NA (для оценки нацеливания на сомы) (Zeiss) и металлогалогенной лампой X-Cite 120 ( Lumen Dynamics) в качестве источника возбуждающего света. Были использованы следующие фильтры возбуждения (ex) и эмиссии (em): ASAP, ex 490/10 нм, em 525/40 нм; FusionRed, ex 555/25 нм, em 620/60 нм. Изображения были получены без разбиения на камеру Orca-ER CCD (Hamamatsu) с программным обеспечением Micro-Manager (Edelstein et al., 2014). Обработка изображений выполнялась с использованием специального алгоритма, написанного в MATLAB, который сегментировал нейроны на области сомы и нейритов и количественно определял флуоресценцию по периметру для обоих каналов. Затем интенсивность флуоресценции ASAP делили на интенсивность FusionRed для получения меры относительной яркости на молекулу или для определения истощения сигнала ASAP3-Kv в нейритах по сравнению с сомой.

    Конфокальная визуализация кортикальных срезов

    Стереотаксические инъекции AAV, экспрессирующих ASAP3 и ASAP3-Kv, проводили на мышах C57BL / 6 под анестезией кетамином / ксилазином.AAV1 .EF1α.ASAP3.bGHpA или AAV1 .EF1α.ASAP3-Kv.bGHpA разбавляли 1: 5 и совместно вводили с AAV1-hSyn-Cre, разведенным 1: 500. 500 нл вирусных смесей вводили со скоростью 200 нл / мин с ASAP3 в левое полушарие (координаты AP 2,5 мм, Ml 2,5 мм, DV 0,33 мм) и ASAP3-Kv в правое (AP 2,5 мм, ML -2,5 мм, ДВ 0,33 мм). Через 20 дней мышам транскардиально перфузировали 4% Antigenfix (Diapath) и мозг фиксировали в течение ночи в Antigenfix, а затем PBS в течение пяти часов. Срезы толщиной 50 мкм вырезали на вибратоме VT100S (Leica) и помещали на предметные стекла между покровными стеклами в Vectashield (Vector Labs).Изображения были получены с помощью LSM 510 (Zeiss) и отображены как максимальная проекция конфокальных z-стеков.

    Электрофизиология патч-зажима и двухфотонная визуализация в острых стриарных срезах

    Стереотаксические инъекции проводили на 40-60 сутки постнатального мышей C57BL / 6 под кетаминовой анестезией. 900 нл AAV9-hSyn-ASAP3-Kv.WPRE вводили односторонне (правое полушарие) в дорсолатеральное полосатое тело (AP 1,2 мм, ML -2 мм и DV -3,2 мм от брегмы). Инъекцию проводили с помощью микропипетки (VWR), вытянутой за длинный узкий наконечник (размер ~ 10–20 мкм) с помощью съемника микропипеток (Sutter Instrument).Стеклянную микропипетку вставляли в мозг и вводили вирус со скоростью инфузии 200 нл / мин. Пипетку осторожно извлекали через 5 мин после окончания инфузии и зашивали кожу головы. Животных использовали через 4–12 недель после инъекции AAV. Корональные срезы головного мозга (300 мкм), содержащие дорсальное полосатое тело, получали с использованием стандартных методик (Ding et al., 2008). Вкратце, животных анестезировали изофлураном и декапитировали. Мозг подвергали воздействию охлажденной ледяной искусственной спинномозговой жидкостью (AcSF), содержащей 125 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2 , 1,25 мМ NaH 2 PO4, 1 мМ MgCl 2 , 25 мМ NaHCO3 и 15 мМ D-глюкоза (300–305 мОсм). Срезы головного мозга готовили с помощью вибрирующего микротома (Leica VT1200 S, Германия) и оставляли для восстановления в ACSF при 34 ° C в течение 30 минут с последующей инкубацией при комнатной температуре (20–22 C) в течение как минимум дополнительных 30 минут перед переносом в прибор. записывающая камера. Срезы были записаны в течение 5 часов после восстановления. Все растворы были насыщены 95% O 2 и 5% CO 2 .Средние шиповатые нейроны полосатого тела (MSN) визуализировали с помощью освещения с помощью инфракрасного дифференциального интерференционного контраста (DIC), а нейроны, экспрессирующие ASAP3-Kv, идентифицировали с помощью эпифлуоресцентного освещения на микроскопе BX-51, оборудованном водно-иммерсионным объективом 60 × 1.0-NA и DIC. оптика (Olympus) и дуговая лампа Lambda XL (Sutter Instrument). Запись всей ячейки с помощью токовых клещей выполнялась с помощью микроэлектродов из боросиликатного стекла (3–5 МОм), заполненных внутренним раствором на основе K + (135 мМ KCH 3 SO 3 , 8.1 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 8 мМ Na 2 -фосфокреатин, 0,3 мМ Na 2 GTP, 4 мМ MgATP, 0,1 мМ CaCl 2 , 1 мМ EGTA, pH 7,2–7,3, 285–290 мОсм) . Сопротивление доступа было <25 МОм и компенсировалось применением балансировки моста. Чтобы вызвать срабатывание MSN, подавались 2-миллисекундные импульсы тока 2 нА, чтобы вызвать выбросы на разных частотах (10, 50, 100 или 200 Гц). Записи были получены с помощью усилителя Multiclamp 700B (Molecular Devices) с использованием программного обеспечения WinWCP (Университет Стратклайда, Великобритания).Сигналы фильтровались с помощью фильтра Бесселя на 2 кГц для устранения высокочастотного шума, оцифрованного на 10 кГц (NI PCIe-6259, National Instruments). Двухфотонная визуализация выполнялась с помощью специально созданного двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа, как описано ранее (Carter and Sabatini, 2004), оснащенного настраиваемым (690–1040 нм) с синхронизацией мод (690–1040 нм) Mai Tai eHP DS Ti: сапфировым лазером (Spectra -Физика) настроен на 920 нм. Сигналы ASAP3-Kv были получены с помощью линейного сканирования с частотой 1 кГц через мембранную область клетки. Сигналы, записанные вдоль каждой линии, были интегрированы для получения графика флуоресценции с течением времени.

    Электрофизиология патч-зажима в культивируемых срезах гиппокампа

    Приготовление и культивирование органотипических срезов гиппокампа выполняли, как описано ранее (Chamberland et al., 2017). Вкратце, на 2–4 дни после подготовки среза, GEVI, клонированные в векторные плазмиды pcDNA3.1 / Puro-CAG, подвергали объемной электропорации с помощью электрического стимулятора Grass Technologies (Natus, Pleasanton, CA). 10 импульсов (50 В) подавались с частотой 10 Гц. Срезы инкубировали в течение 7 дней после трансфекции перед началом экспериментов, когда их осторожно клали ровно и неподвижно с нейлоновой сеткой в ​​электрофизиологической камере.Во время экспериментов срезы непрерывно перфузировали оксигенированным (смесь 95% O 2 и 5% CO 2 ) раствором искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), содержащим 124 мМ NaCl, 25 мМ NaHCO 3 , 2,5 мМ KCl, 1,2 мМ MgCl 2 , 2,5 мМ CaCl 2 , 10 мМ глюкозы (pH = 7,4, 300 мОсм). ACSF нагревали до температуры 32 ± 2 ° C, измеренной в записывающей камере, или хранили при комнатной температуре, что приводило к ACSF при 20 ± 2 ° C в записывающей камере.Сканирующий градиентный контраст Do dt использовался для направления пипетки относительно среза для записи патч-зажим. Нейроны, экспрессирующие ASAP, идентифицировали при двухфотонном освещении. Пипетку (сопротивление в ванне 3–5 МОм) осторожно подводили к целевым нейронам. Внутриклеточный раствор содержал 120 мМ K-глюконат, 20 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 2 мМ MgCl 2 , 2 мМ Mg 2 АТФ, 0,3 мМ NaGTP, 7 мМ фосфокреатин, 0,6 мМ EGTA (pH = 7,2, 295 мОсм). Было приложено небольшое отрицательное давление, чтобы сломать гигауплотнение к конфигурации целых ячеек.Все эксперименты проводились в режиме токового зажима. Электрофизиологический сигнал усиливали с помощью Multiclamp 700B (Molecular Devices) и фильтровали нижними частотами на 2 кГц. Сигнал оцифровывали с частотой 10 кГц с помощью Digidata 1440A (Molecular Devices) и записывали с помощью программного обеспечения Clampex 11.0 (Molecular Devices). Потенциалы действия вызывались прямоугольными импульсами тока длительностью 2–4 мс (1,0–1,5 нА). Испытания регистрировались с 10-секундными интервалами.

    RAMP Запись напряжения в культивируемых срезах гиппокампа

    Для получения изображения напряжения использовался изготовленный на заказ двухфотонный микроскоп с произвольным доступом (RAMP) (Otsu et al., 2008). Титан-сапфировый лазер Chameleon Ultra II (когерентный) с частотой следования 80 МГц (140 фс, средняя мощность> 4 Вт) был настроен на 900 нм. Лазерный луч прошел через акустооптический модулятор для пространственной и временной хроматической компенсации и на пару AOD (AA Opto-Electronics), чтобы быстро направить лазерный луч с размерами x и y в поле зрения. . Лазерный луч передавался через систему 4f от средней плоскости AOD-сканера x-y к задней апертуре 25 × 0.Объектив 95-NA (Leica). Фотоны собирали либо в режиме трансфлуоресценции (через конденсатор), либо в обоих режимах трансфлуоресценции и эпифлуоресценции одновременно. Оба пути обнаружения были одинаковыми. Сигнал пропускали через фильтр короткого прохода на 720 нм, а затем разделяли на два канала с помощью дихроичного зеркала 580 нм (Semrock), в результате чего получали зеленый (ASAps) и красный канал (AlexaFluor 594). Фотоны в зеленом канале подвергались полосовой фильтрации на длине волны 500–560 нм, а фотоны в красном канале – полосовой фильтрации при 595–665 нм (Semrock).Фотоны регистрировались с помощью внешних фотоумножителей H7422P-40 AsGaP (Hamamatsu) в режиме счета фотонов. Подсчет фотонов производился на персональном компьютере, а микроскоп контролировался с помощью программного обеспечения, написанного в LabVIEW (National Instruments).

    Электрофизиология патч-зажима в острых срезах мозжечка

    Для редкой экспрессии ASAP в межнейронах молекулярного слоя мозжечка самцов мышей C57Bl / 6 в возрасте от 4 до 5 недель подвергали глубокой анестезии с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина (14.8 мг / г) и ксилазина (20 мг / г) и закреплены в стереотаксической рамке. Сагиттальный разрез по средней линии обнажил череп над червем мозжечка. В месте инъекции (AP 6,0 мм от брегмы, ML 0 мм от средней линии) просверливали отверстие диаметром 0,5 мм и вытянутый кварцевый капилляр (внешний диаметр 30–50 мкм) спускался на 500 мкм через мозговые оболочки. После 2-минутной паузы капилляр втягивали на 100 мкм, а затем на 0,5 мкл смеси AAV1.cKit :: Cre.bGHpA, разведенной 1: 1000, и AAV9.CAG.FLEx.ASAP3-Kv.WPRE.SV40pA или AAV9.hSyn.FLEx.ASAP2s.WPRE.SV40pA, разведенный 1:10 в физиологическом растворе, вводили под давлением со скоростью 0,1 мкл / мин. После завершения капилляр оставляли на месте еще на 10 минут, затем извлекали и зашивали кожу головы. Затем мышь держали под согревающей лампой до выхода из наркоза, прежде чем, наконец, вернули в стандартный корпус. Спустя 15-20 дней мышей анестезировали изофлураном (4% в медицинском кислороде) и немедленно декапитировали. Мозжечок быстро удалили и поместили в ледяной раствор BBS (125.7 мМ NaCl, 3,3 мМ KCl, 1,25 мМ Nah3PO4, 24,8 мМ NaHCO3, 25 мМ глюкозы, 1,3 мМ CaCl 2 , 1,17 мМ MgCl 2 , 50 нМ миноциклин). Мозжечок приклеивали (Cyanolit) в камеру для нарезки на парасагиттальном срезе и погружали в ледяной раствор для резки (130 мМ K-глюконат, 14,6 мМ KCl, 2 мМ EGTA, 20 мМ HEPES, 25 мМ глюкозы, 50 мкМ D- APV, 50 нМ миноциклин) во время нарезки. Срезы толщиной 290 мкм нарезали с помощью лезвия из нержавеющей стали (отклонение оси z <0,5 мкм) с помощью микротома с осциллирующим лезвием (Campden Instruments) и хранили в теплом (33 ° C) насыщенном кислородом восстанавливающем растворе (225 мМ D-маннита, 2.3 мМ KCl, 1,25 мМ NaH 2 PO 4 , 25 мМ NaHCO 3 , 25 мМ глюкозы, 0,51 мМ CaCl 2 , 7,7 мМ MgCl 2 , 50 мкМ D-APV, 50 нМ миноциклин) в течение нескольких минут перед переносом в камеру с рециркуляцией насыщенного кислородом раствора BBS при 33 ° C. По крайней мере, через 30 минут после разрезания срезы переносили в записывающую камеру на многофотонном микроскопе на основе AOD. Срезы перфузировали насыщенным кислородом раствором BBS со скоростью 3,5 мл / мин при 33 ° C.Патч-электроды из боросиликатного стекла (сопротивление 4–6 МОм) были заполнены внутриклеточным раствором с высоким содержанием хлоридов (135 мМ KMeSO 4 , 6 мМ NaCl, 2 мМ MgCl 2 , 10 мМ HEPES, 4 мМ ATP-Mg, 0,4 мМ Na 2 GTP, рН доведен до 7,35 с помощью КОН (290–295 мОсм). Регистрацию патч-клампа целых клеток проводили с использованием усилителя Multiclamp700B, дигитайзера Digidata и программного обеспечения PClamp10 (Molecular Devices). Интернейроны молекулярного слоя кора мозжечка удерживалась около -70 мВ в конфигурации цельноклеточного токового зажима, и вводились большие токи (1 мс, 300-800 пА), чтобы вызвать спайк.Электрофизиологические сигналы оцифровывались с частотой дискретизации 20 кГц и пропускались через фильтр Бесселя с частотой 5 кГц.

    Быстрое сканирование и голографическое мультиплексирование с AOD для создания сверхбыстрого локального объемного возбуждения (ULoVE)

    AOD ведут себя как формирователи волнового фронта, когда они управляются нестационарными акустическими частотами (Akemann et al., 2015). В любой момент фаза волнового фронта получается как интеграл акустической частоты по оптическому окну AOD. Когда функция акустической частоты ( t ) медленно изменяется относительно времени установления AOD (время распространения акустической волны через оптическое окно), профиль пространственной частоты по апертуре AOD ( L ) может быть хорошо аппроксимирован при все времена по первым членам степенного ряда:

    f (x) = f (L2) + f ′ (L2).x1! + f ′ ′ (L2) .x22! + f ′ ′ ′ (L2) .x33! + ⋯, −L2

    который интегрируется, чтобы дать фазу оптического волнового фронта как:

    φ (x) = A + f (L2) ⋅x + f ′ (L2) x22! + F ′ ′ (L2) .x33! + F ′ ′ ′ (L2) .x44! + ⋯, −L2 < х

    Первый термин относится к поршню и не имеет значения. Второй член в x или y представляет собой наклон волнового фронта, соответствующий положению x-y фокального объема в поле зрения. Если частотные функции, подаваемые на AOD x и y , связаны постоянным смещением, тогда третьи члены объединяются, чтобы сформировать квадратичную кривую волнового фронта:

    в результате получается расфокусировка z .Дальнейшие члены могут быть описаны как различные комбинации полиномов Цернике высшего порядка, представляющие аберрации фокальной точки. Однако, если функция акустической частоты изменяется медленно, вторая и третья производные малы, а дальнейшие члены приводят к незначительным аберрациям фокального объема. По мере того, как акустическая волна распространяется в AOD во времени, члены постоянной и первой производной функции акустической частоты будут изменяться, что приводит к одновременному боковому сканированию x-y и сканированию z .Например, управление AOD x и y с медленными синусоидальными частотными функциями () разных частот и амплитуд позволяет анализировать объем параллелепипеда за несколько десятков микросекунд ().

    Когда функция акустической частоты содержит быстро меняющиеся компоненты относительно времени установления AOD, преобладают более высокие члены степенного ряда, и результирующая картина возбуждения в фокальной плоскости легче вычисляется с помощью голографии, i.е. преобразованием Фурье волнового фронта лазера на выходе АОП. Однако этот голографический узор постоянно меняется по мере распространения акустической волны, не позволяя создать устойчивый голографический объем. Кроме того, цель состоит не в том, чтобы добиться большого расширения фокального объема, а в том, чтобы добиться параллельного возбуждения ограниченного числа фиксированных фокальных точек в определенной области. Эта проблема может быть решена путем генерации изменяющейся во времени акустической частотной диаграммы, продолжающейся n доли времени установления AOD, и повторения этой модели бесконечно от головы до конца.В результате в любой момент волновой фронт, выходящий из АОЗ, можно рассматривать как свертку фиксированного рисунка волнового фронта и дрейфующих равномерно распределенных функций Дирака (). Таким образом, голографическое изображение является продуктом преобразования Фурье образа волнового фронта и преобразования Фурье регулярно расположенных функций Дирака, которое не зависит от фазы функций Дирака. Результирующее изображение, таким образом, состоит из массива фиксированных, равномерно расположенных, ограниченных дифракцией пятен, пиковые интенсивности которых умножаются на преобразование Фурье фиксированного рисунка волнового фронта.Затем этот образец может быть рассчитан стандартными методами для получения желаемого распределения амплитуд, , то есть товарный вагон. Расстояние между пятнами высокой интенсивности в матрице увеличивается с числом повторений n , согласно формуле решетки n линий. Из практических соображений мы использовали простые линейные чирпы в качестве голографических паттернов. Для n = 3, 4 и 5 наклоны линейного чирпа, дающие три точки с одинаковой интенсивностью, составили соответственно 97 МГц / мс, 188 МГц / мс и 292 МГц / мс, а расстояние между точками было соответственно 1.35 мкм, 1,8 мкм и 2,25 мкм. Для 9-кратных мультиплексированных паттернов щебетание было выбрано противоположных знаков в AOD x и y , чтобы ограничить перекомпоновку вне фокуса ().

    ULoVE Регистрация ASAP3 в срезах мозжечка и бодрствующих мышей

    Были выполнены несколько сеансов визуализации продолжительностью 1-3 часа в течение 1-4 дней, в то время как мыши спонтанно вели себя на бегущем колесе в темноте. Поведенческое привыкание включало в себя прогрессивное обращение экспериментатора с постепенным увеличением продолжительности фиксации головы (Villette et al., 2017). Мышей обрабатывали перед сеансами записи, чтобы ограничить стресс, связанный с удержанием, и эксперименты проводили во время светового цикла. Визуализация выполнялась с использованием специально разработанной многофотонной системы с произвольным доступом на основе AOD (система Karthala) на основе ранее описанной конструкции (Otsu et al., 2008) и фемтосекундного лазера на сапфировом титане (Spectra Physics) с синхронизацией мод при 920 нм с частотой следования 80 МГц. Водно-иммерсионный объектив 25x (0,95 нА, рабочее расстояние 2,5 мм, Leica) использовался для сбора возбуждающего и эпифлуоресцентного света.Сигнал пропускали через фильтр короткого прохода на 720 нм, разделяли на два канала с помощью дихроичного зеркала 580 нм (Semrock, Нью-Йорк, США) и передавали на два {“типа”: “entrez-нуклеотид”, “attrs” : {“text”: “h20769”, “term_id”: “875589”, “term_text”: “h20769”}} h20769 / 40 охлаждаемые фотоэлектронные умножители (Hamamatsu) в режиме счета фотонов с зеленым каналом, используемым для ASAP3. Для острых срезов сигнал трансфлуоресценции был аналогичным образом разделен на два канала с использованием дихроичного зеркала 580 нм, собранных двумя {“type”: “entrez-нуклеотид”, “attrs”: {“text”: “h20769″, ” term_id “:” 875589 “,” term_text “:” h20769 “}} h20769 / 40 охлаждаемые фотоэлектронные умножители в режиме счета фотонов и суммируются с сигналом эпифлуоресценции.Метод сканирования локального объема на основе AOD был использован для достижения высокой частоты дискретизации (3-5 кГц) и стабильных записей in vivo. Короче говоря, каждый воксель состоял из параллелепипеда размером примерно 3 × 6 × 6 мкм, сканированного за 100 мкс. Вся флуоресценция в этом объеме была объединена, чтобы получить одно записываемое значение. Для сканирования локального объема нестационарные шаблоны частот кодировались в цифровом виде и подавались на устройство DDS со скоростью 10 МГц. Частотно-модулированный выходной сигнал усиливался и приводил в действие сканеры AOD.Частотные шаблоны состояли из линейных чирпов и синусоидальных модуляций, которые можно было изменять по амплитуде для настройки размера локального объема. Оптический квадратурный кодировщик HEDS-5645 # A06 (Avago Technology) использовался для отслеживания мгновенной скорости мыши на беговом колесе с пространственным разрешением 0,484 мм.

    In vivo Patch-Clamping и оптическая запись ULoVE

    Самцам мышей C57BL6 (n = 3, масса тела 11–14 г) инъецировали на P21 смесь AAV1.hSyn.Cre (конечный титр 3 × 10 9 ГХ / мл) и AAV1.EF1a.ASAP3-Kv (конечный титр 3 × 10 12 ГХ / мл), разбавленные в dPBS. Диагональный стереотаксический подход был использован для дальнейшей помощи при дюрэктомии. В три места инъекции по 400 нл вводили под давлением со скоростью 100 нл / мин при AP 2,6 мм от брегмы и ML 2,8, 2,4 и 2,0 мм от средней линии под углом 64 ° от вертикальной оси. Через три-четыре недели мышей анестезировали изофлураном и помещали в стереотаксическую рамку. Через 20–30 минут анестезию медленно переводили в состояние анестезии уретаном путем внутрибрюшинной инъекции уретана (Sigma, 1.5 г / кг, разведенного в 0,9% NaCl). Небольшая трепанация черепа выполнялась путем создания препарированного черепа с последующим аккуратным вскрытием кости до формы 0,7 × 1,2–1,6 мм соответственно переднезаднего и медиолатерального размеров. Затем к черепу приклеивали головную пластину и открывали твердую мозговую оболочку, не повреждая поверхность мозга, которая поддерживалась ирригацией с помощью внешнего ACSF. Затем животных закрепляли под двухфотонным микроскопом ULoVE-RAMP на грелке с обратной связью, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 36–37 ° C.Боросиликатная пипетка с сопротивлением 5-7 МОм, заполненная внутриклеточным раствором (130 мМ K-глюконат, 0,6 мМ EGTA, 2 мМ MgCl 2 , 0,2 мМ CaCl 2 , 10 мМ HEPES, 5 мМ KCl, 2 мМ MgATP, 0,3 мМ Na 2 GTP) с 25 или 50 мкМ гидразида Alexa Fluor 594 опускали в зрительную кору при положительном давлении 20-30 мПа до достижения целевой ASAP3-Kv, экспрессирующей нейроны L2 / 3. Был достигнут режим всей ячейки (со средней вероятностью успеха 50%), и была выполнена компенсация емкости.Сомы клеток загружали красным красителем до начала регистрации ULoVE. Записи токовых клещей оцифровывались с частотой 20 кГц (Digidata 1440A, Axon). Записи ULoVE были выполнены с использованием тех же настроек, что и для экспериментов в бодрствующем состоянии (см. Ниже) при 3,3 или 4,16 кГц. Одновременные записи продолжались до тех пор, пока качество всей клетки не было нарушено, или до 8 мин.

    Экспрессия ASAP
    In Vivo для записей во время пробуждения

    AAV1.hSyn.Cre или AAV1.CamKII.Cre, разведенный 1: 1000, и AAV1.CAG.Flex.ASAP3-Kv или AAV9.CAG.Flex.ASAP3-Kv, разведенные от 1: 5 до 1: 100, объединяли с фосфатно-солевым буфером (PBS), 400 нл которого вводили. взрослым самцам мышей C57BL / 6 дикого типа (масса тела 25–30 г) при скорости потока 50 или 100 нл / мин внутрь и зрительной коры (координаты V1 от bregma: AP −3 мм, ML −2,5 мм и DV -0,3 мм от поверхности мозга. Использовали предоперационный анальгетик (бупренорфин, 0,1 мг / кг). Вкратце, канюлю со стеклянным дном вводили поверх дорсального гиппокампа после аспирации коры и фиксировали Kwik-Sil в интерфейс ткани и Superbond на уровне черепа.Для первичной зрительной коры покровное стекло толщиной 5 мм помещали поверх целевой области коры сразу после вирусной инъекции и фиксировали зубным цементом. Специально разработанная алюминиевая пластина головы была закреплена на черепе слоями стоматологического цемента после имплантации покровного стекла. Мышам давали возможность восстановиться в течение как минимум 15 дней перед сеансами визуализации и помещали по одной в клетку. Для экспериментов на клетках PV гиппокампа самкам и самцам мышей PV :: cre (n = 2, масса тела 25–29 г) вводили вирус в область CA1 гиппокампа (координаты из bregma: AP -2.3 мм, ML −2 мм и DV −1,3 мм от поверхности мозга, как указано выше, а хирургическое вмешательство в гиппокампе было выполнено через 7–14 дней, как описано ранее (Dombeck et al., 2010; Villette et al., 2017), но без ограничение воды.

    Генетические индикаторы напряжения | BMC Biology

    Подобно тому, как Лейбниц входит в свою мельницу разума, представьте, что он наблюдает в реальном времени за работой нервной системы с нейронами, получающими возбуждающий и тормозной постсинаптические потенциалы (EPSP и IPSP соответственно), интегрируя их в общую электрическую систему. ответ и генерирование потенциалов действия (AP), которые передаются другим нейронам.Такой эксперимент в сновидениях, являющийся своего рода «святым Граалем» нейробиологии, можно было провести с помощью визуализации мембранного потенциала. Аромат этого уже можно оценить по визуализации кальция [1,2,3], где, используя либо органические, либо генетически закодированные индикаторы кальция, можно отслеживать активность популяций нейронов у бодрствующих животных, хотя и с медленным разрешением по времени и без способность наблюдать отдельные спайки во время высокочастотных последовательностей спайков или измерять синаптические потенциалы [4,5,6].

    Визуализация напряжения нейронов затруднена по многим причинам. Хотя мембранный потенциал весьма значителен по амплитуде (до десятых долей вольта), он существует в ограниченном пространстве, тонкой плазматической мембране и связанной с ней дебаевской длине, толщиной всего несколько нанометров. Из-за этого, чтобы измерить электрическое поле, датчики должны быть нацелены с нанометровой точностью, с небольшой вероятностью ошибки. Более того, датчики должны быть специально нацелены на плазматическую мембрану, поскольку подавляющее большинство клеточных мембран являются внутриклеточными, которые, будучи помечены датчиками напряжения, вносят только фоновый вклад в сигнал.Помимо этой задачи нацеливания, абсолютная тонкость мембраны означает, что там можно разместить только несколько сенсорных молекул, поэтому об изменениях напряжения можно сообщить только с использованием очень небольшого количества фотонов, требующих эффективных хромофоров, сильных источников света и временного или пространственного усреднения. Тем не менее, сигналы напряжения мембраны являются миллисекундными, а нейроны имеют богатую дендритную или аксональную морфологию, где сигналы напряжения необходимо измерять, что затрудняет пространственное или временное усреднение. Еще больше усложняет ситуацию то, что даже если нацеливание было эффективным и метило все клетки и процессы, клубок нейропиля млекопитающих остается оптически неразрешимым для традиционной микроскопии.Кроме того, мембранные потенциалы имеют градацию по амплитуде, поэтому измерения должны иметь значительный динамический диапазон с, в идеале, линейными передаточными функциями в физиологическом диапазоне от – 100 до 100 мВ. Последняя трудность возникает, поскольку плазматическая мембрана – это не просто еще один клеточный компартмент, а именно тот, который защищает нейрон извне и целостность которого имеет первостепенное значение. Это делает его чрезвычайно чувствительным к любым возмущениям, от добавления дополнительных молекул или зарядов, которые могут повлиять на его биохимические или электрические свойства, до фотоповреждений от образования свободных радикалов кислорода из-за фотовозбуждения индикаторов напряжения или эндогенных хромофоров.

    Этот запретительный набор трудностей не остановил исследователей от работы с изображениями напряжения [7,8,9], что привело к появлению множества различных методологических подходов, демонстрирующих большую изобретательность [10]. В самом деле, в методах оптического измерения мембранного потенциала используются самые разнообразные стратегии, такие как (i) повторное разделение, когда хромофоры перемещаются в мембрану и выходят из нее с изменениями напряжения; (ii) переориентация, при которой электрическое поле изменяет относительное выравнивание хромофора относительно мембраны; (iii) электрохромизм, когда мембранный потенциал модулирует основное и возбужденное состояния хромофора, изменяя длину волны возбуждения или излучения; (iv) резонансный перенос энергии Ферстера (FRET), когда вызванные напряжением конформационные или спектральные изменения изменяют эффективность передачи энергии хромофоров; (v) тушение, когда мембранный потенциал влияет на молекулярные взаимодействия, которые уменьшают интенсивность флуоресценции; (vi) индуцированная напряжением димеризация / агрегация хромофоров, изменяющая их спектры; (vii) электрооптическая модуляция генерации второй гармоники (ГВГ) хромофоров; (viii) плазмонный эффект наночастиц по усилению сигналов от соседних хромофоров; и (ix) отображение показателя преломления или других внутренних оптических изменений в клетке из-за ее электрической активности.

    Используя некоторые из этих механизмов, за последние четыре десятилетия исследователи синтезировали органические потенциалочувствительные красители для измерения мембранного потенциала in vitro и in vivo [7,8,9, 11,12,13,14]. Эти красители были особенно эффективны в препаратах беспозвоночных с большими и прочными нейронами и с небольшим нейропилем [15,16,17], а также в некоторых препаратах млекопитающих, либо in vitro [18, 19], либо путем инъекции красителей в отдельные клетки [ 20, 21], или использовать их для измерения объема ткани in vitro [22, 23] или in vivo, но без разделения отдельных клеток [8].Несмотря на эту новаторскую работу, вольтажная визуализация препаратов млекопитающих in vivo с разрешением отдельных клеток остается проблемой, а визуализация активности нейронных цепей in vivo вместо этого обычно выполняется с помощью кальциевых индикаторов в сочетании с двухфотонным возбуждением для оптического проникновения и секционирование [4, 24, 25].

    Недавняя разработка генетически кодируемых индикаторов напряжения (GEVI) представляет собой новую стратегию, которая с помощью белковой инженерии может преодолеть некоторые ограничения органических красителей, чувствительных к напряжению (рис.1). Основываясь на успешной разработке генетически кодируемых индикаторов кальция [26], открытие чувствительного к напряжению домена (VSD) из фосфатазы [27, 28] позволило создать семейство GEVI, связав его с флуоресцентными белками в различных конфигурациях ( Рис.1, слева). Кроме того, было разработано второе семейство GEVI на основе микробных родопсинов, которые демонстрируют слабую, но чувствительную к напряжению флуоресценцию [29]. Наконец, третья категория генетических датчиков напряжения использует гибридный подход с взаимодействием органических и белковых компонентов [30], используя совместные преимущества химического и генетического дизайна.В следующих разделах мы даем краткий обзор этих трех семейств генетических индикаторов напряжения и приводим сравнение их эффективности в таблице 1. Учитывая, насколько быстро эта область развивается, наш обзор является лишь моментальным снимком во времени, и мы поощряем читателя. чтобы быть в курсе новых показателей напряжения по мере их публикации.

    Рис. 1

    Исторический обзор генетических индикаторов напряжения. Датчики делятся на три различных семейства на основе доменов измерения напряжения (VSD; слева, ), микробных родопсинов (, средний ) или хемогенетических зондов ( справа, ) и расположены в хронологическом порядке в соответствии с годом первого отчета.Цвет рамки относится к длине волны активации, указанной в документе или полученной из спектра флуоресцентного белка. Черные звезды обозначают зарегистрированные двухфотонные измерения. Обратите внимание, что HAPI-Nile Red и Voltron также основаны на родопсине. См. Текст для ссылок

    Таблица 1 Сравнительная характеристика генетически ориентированных индикаторов напряжения. Значения взяты из литературы. NR не сообщается, RT комнатная температура

    Чувствительные к напряжению GEVI на основе домена

    Индикаторы напряжения на основе VSD состоят из VSD и флуоресцентного белка (рис.2а). Первый индикатор напряжения на основе VSD, FlaSh, использовал VSD из потенциалзависимого калиевого канала [31], но имел ограниченное применение в препаратах для млекопитающих. Совсем недавно VSD фосфатазы из Ciona Кишечник [27] систематически использовался для создания GEVI с улучшенным переносом через мембрану и повышенной производительностью [32, 33]. Скрининг флуоресцентных белков, слитых с этим VSD, привел к созданию ArcLight, состоящему из VSD и мутантного суперэклиптического pHluorin [34]. Хотя ArcLight обладает хорошей чувствительностью к напряжению, его медленная кинетика флуоресценции приводит к низкой амплитуде сигнала и ограниченному временному разрешению для обнаружения пиков.Для ускорения кинетики в Ciona VSD были введены мутации, что дало улучшенные варианты ArcLight [35,36,37]. В качестве альтернативы VSD Ciona , VSD другой потенциалочувствительной фосфатазы из Gallus gallus был использован для вставки GFP суперпапки с круговой перестановкой во внеклеточную петлю VSD, между третьей и четвертой трансмембранными спиралями, для более быстрого получения индикаторы напряжения, получившие название ускоренного датчика потенциалов действия (ASAP) [38,39,40,41].В последнее время были предприняты попытки изменить полярность оптических сигналов; в отличие от некоторых из более ранних индикаторов, эти новые индикаторы напряжения (Marina, FlicR1 и FlicR2) увеличивают яркость, когда мембрана деполяризована, и демонстрируют более низкую флуоресценцию при потенциалах покоя мембраны (рис. 2b, c) [42, 43]. Кроме того, недавно были разработаны GEVI на основе VSD (рис. 2b) [42, 44, 45].

    Рис. 2

    Последние GEVI на основе VSD. a Схематический чертеж двух конфигураций GEVI на основе VSD. Слева : слияние VSD с внутриклеточным флуоресцентным белком (FP). Справа : вставка ДМЖП с внеклеточной циркулярной перестановкой FP. b Слева : Экспрессия FlicR1, индикатора с красным смещением и обратной полярностью, в диссоциированном нейроне гиппокампа. Правый : оптический ( красный ) и электрический ( черный ) отклики на потенциалы действия с частотой 5 Гц, записанные с помощью однофотонной визуализации. Изменено с разрешения [43]. c Слева : Экспрессия Марины, зеленого индикатора с обратной полярностью в культивируемых нейронах гиппокампа. Справа : Спонтанная импульсная активность в корковом нейроне острого среза головного мозга, зарегистрированная с помощью однофотонной визуализации. Изменено из [44] с разрешения

    GEVI на основе

    VSD успешно использовались для измерений как одиночных нейронов, так и нейронных цепей, позволяя регистрировать динамику мембранного потенциала в небольших нейронных компартментах, труднодоступных с помощью обычных электрофизиологических методов. Например, измерения мембранного потенциала в дендритных шипах in vitro были выполнены с помощью ArcLight, сочетая однофотонную визуализацию напряжения с двухфотонным снятием каркаса глутамата [46].Кроме того, потенциалы действия в дендритах, распространяющиеся в обратном направлении, регистрировались с помощью ASAP2s с двухфотонной микроскопией [40]. GEVI на основе VSD также использовались in vivo. С помощью одно- или двухфотонной визуализации напряжения в широком поле можно отобразить сенсорно-вызванные или спонтанные потенциалы с больших территорий, хотя и без разрешения отдельных клеток [47,48,49]. Мониторинг подпороговой динамики мембранного потенциала и потенциалов действия с клеточным разрешением был достигнут in vivo с использованием VSD на основе GEVI у Drosophila [39, 50].Но визуализация напряжения с разрешением отдельных клеток in vivo была сложной задачей для препаратов млекопитающих из-за рассеяния света и плохого отношения сигнал / шум (SNR). Недавно и ArcLight-MT, и недавно разработанный ASAP3 были использованы для регистрации подпороговых потенциалов и потенциалов спонтанного действия у бодрствующих или анестезированных мышей in vivo при двухфотонном возбуждении с разрешением одной клетки [49]. Кроме того, визуализация вольтамперометра и визуализация кальция также недавно были объединены у плодовых мушек in vivo [39].

    Хотя производительность GEVI на основе VSD улучшилась, создание изображений напряжения с их помощью все еще остается сложной задачей. Необходимы дальнейшие успехи, особенно в области визуализации in vivo. В частности, желательны лучшие характеристики при двухфотонном возбуждении и разработка индикаторов с красным смещением для многоцветной визуализации и комбинации с оптогенетикой. Также представляется важным разработать более яркие GEVI на основе VSD, чтобы получить более высокие отношения сигнал / шум, сравнимые с визуализацией кальция. Наконец, как и в случае с другими индикаторами напряжения, быстрое фотообесцвечивание GEVI на основе VSD может помешать долгосрочному мониторингу динамики мембранного потенциала.Чтобы преодолеть фотообесцвечивание, улучшение GEVI типа Marina и FlicR кажется особенно многообещающим, поскольку они показывают низкую флуоресценцию в состоянии покоя и становятся ярче при деполяризации мембранного потенциала.

    GEVI на основе родопсина

    GEVI на основе микробных родопсинов делятся на два различных класса. Один использует родопсин и как датчик напряжения и как флуоресцентный репортер, в то время как другой использует чувствительный к напряжению родопсин, связанный с флуоресцентной меткой (рис. 3a). Первым микробным датчиком напряжения на основе родопсина был PROPS (оптический датчик протонов протеородопсина) [51].Авторы обнаружили, что в протеородопсине, поглощающем зеленый цвет, состояние протонирования основания Шиффа сетчатки (RSB), которое ковалентно прикрепляет хромофор к апопротеину, в значительной степени определяет цвет и флуоресценцию родопсина. Они пришли к выводу, что изменение мембранного напряжения должно влиять на локальный электрохимический потенциал вокруг RSB и тем самым изменять флуоресценцию белка [51]. Посредством мутагенеза естественная светоактивированная ионная транспортная активность микробного родопсина была отменена, и RSB pk a был сдвинут, чтобы воспринимать мембранные потенциалы в физиологическом диапазоне.Использование PROPS было ограничено Escherichia coli , но, используя аналогичный механизм восприятия, Archaerhodopsin 3 галоархей Halorubrum sodomense , известный как Arch, был впоследствии разработан для визуализации напряжения нейронов млекопитающих [29]. В последние годы усовершенствования сенсоров на основе родопсина в основном связаны с мутациями в Arch [52, 53], что привело к улучшенным индикаторам, таким как QuasAr 1-3 [54, 55], NovArch [56] и, недавно, Archon 1 и 2. [57] (рис. 1). И QuasAr3, и Archon1 были использованы для успешной регистрации поездов потенциала действия in vitro с хорошим SNR [55, 57] (Table 1) и использовались in vivo, хотя и с однофотонным возбуждением [55, 57].

    Рис. 3

    Недавние ГЭВИ на основе родопсина. a Представление двух видов GEVI на основе родопсина с GEVI типа PROPS ( слева, ) и GEVI на основе eFRET ( справа, ). b Слева : конфокальные изображения экспрессии QuasAr3 в срезах мозга; стержень 50 мкм. Средний : записи патч-зажим (, черный, ) с соответствующими следами флуоресценции (, красный, ) в острых срезах головного мозга. Справа : наложение электрического и оптического сигнала для одной точки доступа.Изменено с разрешения [55]. c Left : Экспрессия Archon1 в острых срезах головного мозга; стержень 25 мкм. Средний : флуоресценция Archon1 ( розовый ; одно испытание) и соответствующие электрические следы ( черный ) в культивируемых клетках с наложением обоих сигналов для AP, указанных стрелкой. Справа : Изменения флуоресценции (единичное испытание) Archon 1 после изменения напряжения, подобного потенциалу действия (, черный ), частотой 200 Гц в нейроне с ограниченным напряжением в культуре.Изменено с разрешения [57]. d Слева : конфокальное изображение экспрессии VARNAM в пирамидных нейронах в фиксированных постнатальных срезах головного мозга. Средний : одновременные оптические (, красный, ) и электрические записи (, черный, ), вызванные подачей тока 10 Гц ( слева, ) и 50 Гц ( справа, ) с наложением обоих сигналов для указанной точки доступа. Правый : Изменения мембранного потенциала, вызванные активацией канала родопсина Cheriff ( синий ), отслеживаются электрически ( черный ) и оптически ( красный ).Изменено с разрешения [44]

    Комбинация сенсора и репортера в одном маленьком белке в микробных родопсинах кажется элегантной и обеспечивает время отклика в субмиллисекундном диапазоне [29, 51, 54, 58] и, кроме того, большую чувствительность ( как ΔF / F на 100 мВ) от 30 до 90% [53,54,55,56,57] делают их очень многообещающими. Тем не менее, как индикаторы напряжения, микробные родопсины страдают недостатками, которые не смогли преодолеть даже самые последние варианты. Поскольку белки оптимизированы для переноса ионов, а не флуоресценции, их квантовый выход обычно на порядки ниже, чем у флуоресцентных белков, таких как GFP [29], что создает низкую яркость и требует высокой интенсивности освещения в диапазоне от нескольких десятков до сотен Вт / см. 2 , даже для последних вариантов [55, 57].Для повышения яркости микробные родопсины были объединены с флуоресцентными белками, в результате чего получилась вторая подгруппа сенсоров на основе родопсина: электрохромные FRET (eFRET) GEVI (рис. 3a), где родопсин по существу служит VSD. Здесь флуоресцентный белок слит на С-конце с седьмой трансмембранной спиралью, обеспечивая чувствительное к напряжению безызлучательное тушение флуорофора с помощью родопсина, механизм, уже исследованный ранее с органическими красителями [59]. Первоначальные подходы объединили макродопсин, световой протонный насос из L.maculans (пик поглощения 550 нм) до mCitrine или mOrange2 [60]. Хотя MacQ-mCitrine и mOrange2 немного медленнее, чем сенсоры чистого родопсина, они все же генерируют полный амплитудный ответ в течение 5 мс и достоверно сообщают о потенциалах действия в культивируемых нейронах с 5-7% ΔF / F на спайк [60]. Следуя тому же подходу, QuasAr2 был слит с несколькими флуоресцентными белками (eGFP, Citrine, mOrange2, mRuby2), что дало сенсоры со сходной кинетикой и чувствительностью [61]. Используя более быстрый родопсин Acetabularia (Ace) в качестве гасителя для mNeonGreen, время отклика может быть значительно ускорено без потери чувствительности [62].Последним дополнением к GEVI eFRET является недавно опубликованный VARNAM, который также использует Ace, связанный с флуоресцентным белком mRuby3. VARNAM требует низкой интенсивности света (1,5 Вт / см2), сохраняет быструю кинетику Ace-mNeonGreen и демонстрирует высокую фотостабильность [44], в то время как его активация с красным смещением делает его легко комбинируемым с оптогенетическими приводами, активируемыми синим светом. Однако даже VARNAM не смог преодолеть недостаток GEVI на основе родопсина: слабую производительность при двухфотонном освещении [44].

    Хемогенетические индикаторы

    Хотя GEVI имеют то преимущество, что они могут быть генетически нацелены на плазматические мембраны и клеточные популяции, они могут иметь недостатки из-за низкой яркости, плохой фотостабильности и медленной кинетики. Но, как уже упоминалось, оптические измерения потенциала клеточной мембраны выполнялись на протяжении десятилетий с небольшими органическими синтетическими молекулами [12, 13, 15]. Эти красители чувствительны к напряжению, часто из-за электрохромизма, и могут иметь большие частичные изменения флуоресценции и отличные кинетические характеристики и фотофизические свойства [8, 11, 63].В то же время эти маленькие липофильные молекулы вызывают неспецифическое окрашивание ткани, серьезно нарушая SNR и разграничение клеток. Чтобы обойти эти проблемы, появилась гибридная стратегия, использующая вместе химические и генетические индикаторы: сочетание оптических свойств низкомолекулярных флуорофоров с генетическим нацеливанием (рис. 1) [30, 64, 65, 66]. Термин «хемогенетика», обычно используемый для небольшой молекулы, которая активирует генно-инженерные белки, был применен к этим гибридным индикаторам напряжения [67].Мы рассматриваем три общих класса индикаторов хемогенетики в соответствии с молекулярным механизмом сенсорного домена и флуоресцентного репортера.

    Хемогенетические сенсоры на основе FRET

    Один из первых хемогенетических сенсоров, названный гибридным сенсором напряжения (hVOS), использовал экзогенно добавленную липофильную молекулу, которая в зависимости от напряжения подавляла флуоресцентные белки, рекрутированные на мембрану. hVOS использовала двухкомпонентную стратегию на основе FRET, изначально разработанную без генетических компонентов [68], но адаптированную для генетического нацеливания (рис.4а) [69,70,71,72,73]. Первый компонент состоит из флуоресцентного белка с присоединенными фарнезилированными и пальмитоилированными мотивами, которые прикрепляют его к плазматической мембране [70, 72]. Второй компонент – нефлуоресцентное синтетическое соединение дипикриламин (DPA), которое служит в качестве чувствительного к напряжению акцептора FRET (тушителя). Поскольку DPA является липофильным, но отрицательно заряженным, он распределяется в мембране в зависимости от напряжения, перемещаясь во внутренний слой во время деполяризации, что гасит флуоресценцию белка.Но поскольку DPA увеличивает емкость мембраны, следует использовать низкую концентрацию, чтобы не нарушать естественные физиологические реакции [73]. Недавнее использование этого сенсора показывает большую универсальность для представления активности нервной популяции с использованием клеточно-специфического генетического нацеливания у трансгенных мышей (рис. 4b).

    Рис. 4

    Хемогенетические индикаторы напряжения. a Схематическое изображение hVOS, состоящего из флуоресцентного белка, прикрепленного к плазматической мембране, в сочетании с нефлуоресцентным синтетическим соединением дипикриламином (DPA), которое служит в качестве чувствительного к напряжению акцептора FRET. b Сотовая визуализация напряжения с разрешением hVOS. Срезы гиппокампа мышей hVOS :: Fos, экспрессирующие зонд hVOS в гранулярных клетках Cre-Fos-зависимым образом. Слева : флуоресценция в срезах мозга после скрещивания Ai35-hVOS с мышами Cre-Fos, демонстрирующая нейроны, экспрессирующие hVOS, в слое гранулярных клеток гиппокампа. Справа : Ответ четырех нейронов в срезе гиппокампа от мыши hVOS :: Fos на электрическую стимуляцию. c Схематическое изображение VoltageSpy, состоящего из экспрессии SpyCatcher на клеточной поверхности и последующего внеклеточного взаимодействия с красителем VF. d Визуализация субклеточного напряжения с помощью VoltageSpy. Культивированные нейроны гиппокампа, коэкспрессирующие SpyCatcher и ядерный mCherry и меченные VoltageSpy, были захвачены при 500 Гц под широкопольным флуоресцентным микроскопом. Слева : VoltageSpy показано зеленым , а ядерное окрашивание красным . Средний : большее увеличение выбранных дендритных областей. Шкала 20 мкм. Справа : Отображение напряжения в дендритах, показывающее вызванные потенциалы действия в выбранных областях интереса, закодированные цветами, указанными на панели.Изображения и следы изменены с разрешения [69] ( b ) и [82] ( d )

    Второй тип хемогенетических сенсоров на основе FRET использует микробные родопсины в качестве сенсоров [61, 62]. Как уже упоминалось, колебания мембранного напряжения вызывают изменение абсорбции родопсинов, которое можно считывать с помощью сайт-специфически лигированного органического флуорофора. Электрохромный FRET родопсина с помощью лигирования флуорофора (FlareFRET) действует как флуорофор, селективно присоединенный к неприродной аминокислоте, кодируемой внутри родопсина [74].Этот датчик обладает широкой универсальностью, позволяя добавлять цветовую палитру и достигать 35,9% ΔF / F на 100 мВ и отклик в миллисекундах.

    Наконец, недавняя разработка новых родаминовых красителей с высокой фотостабильностью и яркостью, таких как серия Janelia Fluor (JF), привела к разработке Voltron [42]. JFs совместимы с белковыми метками и преодолевают гематоэнцефалический барьер в экспериментах на млекопитающих in vivo. Voltron сочетает в себе чувствительный к напряжению микробный родопсин с самомеченным белковым доменом, который ковалентно связывает синтетический флуорофор JF [75, 76].Зависимые от напряжения изменения в спектре поглощения родопсина обратимо модулируют степень тушения флуоресценции красителя посредством FRET. С помощью Voltron можно измерять импульсные нейронные импульсы и подпороговые напряжения в личиночных рыбках данио, плодовых мушках и мозге мышей [42].

    Хемогенетические сенсоры на основе ферментов

    Эта конструкция основана на генетически закодированном ферменте на поверхности клетки, который активирует предшественник органического индикатора напряжения. Например, водорастворимый краситель-предшественник гидролизуется щелочной фосфатазой, которая отщепляет полярную группу, усиливая ее липофильный характер [30].Это значительно улучшает нацеливание и накопление модифицированного электрохромного красителя в мембране клетки, экспрессирующей фосфатазу. Хромофор аминостирилпиридиния (ASP) является примером предшественника чувствительного к напряжению красителя с фосфатной группой, присоединенной к его головной группе [30, 65]. Первое поколение красителей на основе ASP приводило к окрашиванию внутренних органелл за секунды. Используя ту же стратегию, второе поколение сенсоров с использованием ANNINE-6, одного из наиболее чувствительных к напряжению красителей, показало изменение интенсивности ΔF / F на 50% на 100 мВ и могло быть использовано для нацеливания in vivo [66].Одним из основных преимуществ этих методов является то, что мембраны можно маркировать большим количеством молекул.

    Новое поколение сенсоров на основе ферментов (VF-EX) представляет собой хемогенетический зонд, в котором генетически кодируемая эстераза выводит из клетки краситель VF в определенных нейронах [77]. Затем VF использует фотоиндуцированный перенос электронов (PeT) в качестве триггера интенсивности флуоресценции, зависящего от мембранного потенциала [78,79,80]. VF обладает скоростью, яркостью и чувствительностью, чтобы сообщать о потенциалах действия в нейронах в единичных испытаниях.Кроме того, VF химически модифицирован, чтобы он был минимально флуоресцентным в качестве предшественника и активируется при ферментативной активности. Нацеленная эстераза печени свиньи (PLE) на мембране расщепляет VF на поверхности клетки [81]. Используя этот подход, можно измерить потенциалы действия в культивируемых нейронах [77]. Кроме того, по сравнению с некоторыми GEVI [70], VF-EX показывает улучшенное SNR и изменение флуоресценции, маркируя дендриты и дендритные шипы [77].

    Хемогенетические датчики с привязкой к метке

    Последняя категория хемогенетических зондов улавливает химические флуорофоры в плазматической мембране с помощью белкового каркаса.В системе VoltageSpy используется сконструированная молекула клеточной адгезии, взаимодействующая с красителем VF, содержащим саркозин (рис. 4a). Это взаимодействие стало возможным благодаря линкеру полиэтиленгликоля (ПЭГ) между небольшим пептидом из 13 остатков и красителем VF [82]. Локализация VoltageSpy определяется экспрессией белка SpyCatcher на клеточной поверхности. Об улучшении обнаружения напряжения по сравнению с обычно используемыми генетическими индикаторами напряжения в культуральных клетках сообщалось для VoltageSpy [82].Используя этот датчик, можно измерять напряжения в терминалах аксонов, дендритах и ​​шипах (рис. 4d). Наконец, гибридный сенсор, прикрепленный к белковой метке, HAPI-Nile, основанный на индикаторе напряжения Nile Red, демонстрирует флуоресцентные изменения в физиологическом диапазоне мембранного потенциала [83]. С помощью этого зонда можно обнаруживать запускаемые потенциалы действия и над / подпороговую активность в культивируемых нейронах.

    Селективная локализация синтетического индикатора напряжения в интересующих клетках с использованием генетически закодированных белковых тегов кажется многообещающей.Некоторые проблемы, связанные с этими гибридными хемогенетическими стратегиями, связаны с их потенциальной токсичностью и избирательным применением экзогенного липофильного соединения к нейрональным мембранам в интактной ткани для использования in vivo.

    Дальний красный индикатор гибридного напряжения, активированный биоортогональной инженерией родопсина на живых нейронах

    Статьи

    https://doi.org/10.1038/s41557-021-00641-1

    1 Колледж химии и молекулярной инженерии, Синтетика и Центр функциональных биомолекул, Пекинская национальная лаборатория молекулярных наук, Key

    Лаборатория биоорганической химии и молекулярной инженерии Министерства образования, Пекинский университет, Пекин, Китай.2Школа наук о жизни,

    Университет Цинхуа, Пекин, Китай. 3Пекинский центр наук о жизни Цинхуа, Пекин, Китай. 4PKU-IDG / Институт исследования мозга Макговерна, Пекин,

    Китай. 5Китайский институт исследований мозга (CIBR), Пекин, Китай. 6Эти авторы внесли равный вклад: Шучжан Лю, Чан Линь, Юнсянь Сюй.

    ✉ электронная почта: [email protected]; [email protected]

    Мембранный потенциал является ключевым биофизическим сигналом, передаваемым жизни.Действия ионоселективных насосов и каналов

    создают дисбаланс заряда на биологической мембране,

    устанавливают динамическое трансмембранное электрическое поле, которое может изменяться

    во времени в миллисекундах. Это электрическое поле может, в свою очередь, регистрировать активность множества локализованных на мембране биомолекул,

    включая потенциал-зависимые ионные каналы и рецепторы, связанные с G-белками1. Мембранный потенциал

    традиционно измеряли с помощью электродных методов, таких как метод фиксации целых клеток

    .Несмотря на свою высокую чувствительность, электродные методы

    часто страдают отсутствием пространственного разрешения, высокой инвазивностью для клеток

    и низкой пропускной способностью2,3. Оптическая регистрация мембранного потенциала

    предлагает привлекательную альтернативу, позволяющую обойти вышеуказанные ограничения. Были разработаны различные чувствительные к напряжению флуоресцентные индикаторы

    для исследования мембранного потенциала с высоким пространственно-временным разрешением, высокой пропускной способностью и минимально инвазивным, а

    – высокопараллельным способом.Например, генетически закодированные индикаторы напряжения

    (GEVI) используются для определения потенциалов действия (AP) и подпороговых активностей

    из генетически определенных популяций нейронов –

    единиц в культурах клеток4,5, срезах мозга6,7 и живых животных2,3 , 8. Поскольку

    большинство этих GEVI основаны на зеленых или красных флуоресцентных белках

    (FP), их флуоресцентное излучение ограничено длинами волн

    ниже 650 нм.

    Яркий и чувствительный дальний красный индикатор очень желателен, потому что

    он может облегчить одновременную регистрацию мембранного напряжения

    и других важных физиологических сигналов, таких как динамика кальция

    и высвобождение нейромедиатора9.Кроме того, спектр возбуждения

    с красным смещением может обеспечить соединение без перекрестных помех между датчиком изображения

    и оптогенетическими исполнительными механизмами, такими как ионоселективные каналы

    и насосы, многие из которых активируются синим и желтым светом,

    таким образом, позволяя проводить полностью оптическое исследование электро-

    физиологии нейронной цепи10,11. Среди редких примеров датчиков напряжения дальнего красного цвета,

    GEVI на основе родопсина (QuasArs10,12, Archers13 и Archon14)

    воспринимают мембранный потенциал посредством электрохромизма и могут излучать при

    > 650 нм (Таблица 1).Однако естественная флуоресценция родоп-

    sin примерно на два порядка слабее яркого органического красителя

    из-за низкого квантового выхода флуоресценции его хромофора сетчатки

    15. Таким образом, применение этих основанных на родопсине

    GEVI часто требует интенсивного возбуждающего света (> 80 Вт / см2) 10,14, что вызывает опасения по поводу чрезмерного теплового эффекта и фототоксичности16.

    Красители, чувствительные к напряжению в ближнем инфракрасном диапазоне, были разработаны для получения изображений напряжения

    в культурах клеток и срезах головного мозга (Таблица 1) 17–20.

    Хотя подходы к фотоактивации и ферментативному освобождению клеток

    позволили специфично для клеток маркировать чувствительные к напряжению красители, они

    не были распространены на дальние красные индикаторы21–23. Недавно был разработан химический индикатор напряжения

    под названием Voltron путем слияния метки самомеченного белка

    , HaloTag, с чувствительным к напряжению микробом

    родопсин, Ace2 из Acetabularia aceabulum24. Voltron635 имеет пик эмиссии

    на 656 нм и сообщает AP в культивируемых нейронах с

    умеренной чувствительностью примерно -3.5% изменение флуоресценции

    по сравнению с исходным уровнем (ΔF / F0) на AP (таблица 1) 24.

    В этой статье мы сообщаем о новом подходе к получению изображения напряжения

    в дальнем красном спектре с высокой скоростью и чувствительностью. Мы

    применяем ферментно-опосредованное включение зонда для сайт-специфического конъюгирования трансциклооктенового фрагмента с мутантом Ace2, который затем

    дериватизируется с тетразин-конъюгированными органическими флуо-

    рофорами с помощью обратного электронно-требовательного метода Дильса. –Alder cycload-

    dition (IEDDA) реакция.Полученные в результате гибридные индикаторы напряжения

    Дальний красный индикатор гибридного напряжения, активированный

    биоортогональной инженерией родопсина на живых

    нейронах

    Shuzhang Liu1,6, Chang Lin1,6, Yongxian Xu1,2,6, Huixin Luo1, Luxin Peng1, Xiangmei Zeng1,

    Huangtao Zheng1, Peng R. Chen 1,3 ✉ и Peng Zou 1,3,4,5 ✉

    Мембранный потенциал является ключевым аспектом клеточной передачи сигналов и динамически регулируется массив ионоселективных насосов и

    каналов.Флуоресцентные индикаторы напряжения обеспечивают неинвазивную оптическую регистрацию потенциала клеточной мембраны с высоким пространственным разрешением

    . Здесь мы сообщаем о палитре ярких и чувствительных гибридных индикаторов напряжения (HVI) с интенсивностью флуоресценции, чувствительных к изменениям мембранного потенциала посредством электрохромного резонансного переноса энергии Фёрстера. Опосредованное ферментом

    сайт-специфическое включение зонда с последующим циклоприсоединением Дильса-Альдера с обратным потреблением электронов было использовано для создания

    усиленных чувствительных к напряжению родопсинов с гибридной архитектурой краситель-белок.Самый чувствительный индикатор, HVI-Cy3, отображает

    чувствительность к высокому напряжению (-39% ΔF / F0 на 100 мВ) и миллисекундную кинетику отклика, обеспечивая оптическую регистрацию

    потенциалов с частотой дискретизации 400 Гц в течение 10 мин. большая популяция нейронов. Красный индикатор HVI-Cy5

    может быть соединен с оптогенетическими приводами и флуоресцентными индикаторами с зеленым / красным светом, что позволяет проводить полностью оптическое исследование электрофизиологии нейронов

    .

    ПРИРОДНАЯ ХИМИЯ | VOL 13 | МАЙ 2021 г. | 472–479 | www.nature.com/naturechemistry

    472

    Содержимое предоставлено Springer Nature, применяются условия использования. Права защищены

    Яркий и быстрый красный флуоресцентный индикатор напряжения белка, который сообщает об активности нейронов в органотипических срезах мозга

    Молекулярная биология для создания вариантов FlicR.

    ПЦР-амплификацию использовали для конструирования ДНК-матрицы для FlicR. Синтетические олигонуклеотиды (Integrated DNA Technologies) использовали в качестве праймеров для амплификации, а полимеразу Pfu (Thermo Fisher Scientific) использовали для поддержания репликации ДНК с высокой точностью.ПЦР с перекрытием использовали для связывания CiVSD с cpmApple FP. Произвольный мутагенез выполняли с помощью подверженной ошибкам ПЦР-амплификации с использованием полимеразы Taq (New England Biolabs) в присутствии MnCl 2 (0,1 мм) и 800 мкМ избытка dTTP и dCTP. Рандомизацию целевых кодонов проводили с помощью наборов QuikChange Lightning (Agilent Technologies). Эндонуклеазы рестрикции (Thermo Fisher Scientific) использовали для переваривания продуктов ПЦР и векторов экспрессии. Электрофорез в агарозном геле использовали для очистки продуктов ДНК от ПЦР и реакций рестрикционного переваривания.ДНК экстрагировали из гелей с использованием набора для экстракции гелей GeneJET (Thermo Fisher Scientific). Лигирование выполняли с использованием ДНК-лигазы Т4 (Thermo Fisher Scientific).

    ДНК

    , кодирующая первые 242 а.о. из CiVSD (VSD242), была получена с помощью ПЦР-амплификации домена CiVSD от датчика напряжения VSFP3.1 (Lundby et al., 2008) с использованием прямого праймера (FW-BamHI-VSD) и обратного праймера ( RV-cpmApple-VSD242). ДНК, кодирующая вариант cpmApple, была получена с помощью ПЦР-амплификации гена, кодирующего R-GECO1, с использованием прямого праймера (FW-VSD242-cpmApple) и обратного праймера (RV-XbaI-cpmApple).Праймеры RV-cpmApple-VSD242 и FW-VSD242-cpmApple содержат перекрывающуюся область, которую использовали для соединения этих двух генов с помощью перекрывающейся ПЦР. Праймеры RV-cpmApple-VSD242 и FW-VSD242-cpmApple также содержали два полностью рандомизированных кодона (кодоны NNK), которые связывают два гена вместе, создавая 1024 варианта. Длина VSD, амплифицированного с помощью ПЦР, варьировалась (VSD 236, VSD237, VSD238, VSD239, VSD240 и VSD241). Другие наборы перекрывающихся праймеров, наряду с праймером FW-BamHI-VSD и праймером RV-XbaI-cpmApple, использовали для связывания ДНК, кодирующей cpmApple, с более короткими VSD, как описано выше для VSD242.Это привело к библиотеке из 1024 вариантов FlicR для каждой длины VSD.

    ПЦР с предрасположенностью к ошибкам вместе с перетасовкой ДНК были использованы для создания библиотек в следующих раундах направленной эволюции вариантов FlicR из библиотеки VSD239. Продукты ПЦР очищали электрофорезом в агарозном геле, расщепляли и лигировали в модифицированный вектор pcDNA3.1 (+), как описано ниже.

    Плазмида для двойной экспрессии
    E. coli и клеток млекопитающих.

    Вектор для экспрессии в прокариотических и эукариотических системах был сконструирован на основе вектора экспрессии млекопитающих pcDNA3.1 (+). Для облегчения прокариотической экспрессии с помощью реакции QuikChange (Agilent Technologies) вводили сайт связывания рибосомы E. coli (agaggaa) для прокариотической трансляции. Получившийся вектор мы назвали pcDuEx0.5. Транскрипция кодируемых генов зависит от слабой активности промотора цитомегаловируса (CMV) в клетках E. coli (Lewin et al., 2005). pcDuEx0.5 продемонстрировал умеренную экспрессию вариантов FlicR в клетках E. coli и показал сопоставимые уровни экспрессии в клетках HeLa по сравнению с исходной pcDNA3.1 (+). Мы использовали pcDuEx0.5 в качестве вектора для скрининга библиотек FlicR. Другие векторы двойной экспрессии были разработаны ранее (Mullinax et al., 2002).

    Плазмида для экспрессии нейронов.

    Для экспрессии FlicR1 в нейронах FlicR1 клонировали из плазмиды pcDuEx0.5 в сайты BamHI / HindIII вектора AAV2 с использованием праймеров FW-BamHI-VSD и RV-HindIII-cpmApple. Экспрессию FlicR1 контролировали с помощью промотора синапсина I человека, который предпочтительно экспрессировался в нейронах. Последовательность 3′-посттранскрипционного регулирующего элемента вируса гепатита сурка (WPRE) использовали для усиления экспрессии.Для экспрессии канального родопсина слитый TsChR-TS-eGFP был клонирован в ту же плазмиду, где TS представляет собой последовательность KiR2.1-трафика, используемую для улучшения мембранного транспорта канальных родопсинов. Аминокислотная последовательность последовательности TS – KSRITSEGEYIPLDQIDINV. ChR2 (h234R) -eGFP экспрессировался из лентивирусной конструкции под промотором CaMKII, описанным ранее (Hochbaum et al., 2014).

    Скрининг вариантов библиотеки FlicR в
    E. coli .

    Генные библиотеки вариантов FlicR были трансформированы в электрокомпетентные E.coli штамм Dh20B (Invitrogen). Затем клетки E. coli высевали и культивировали при 37 ° C на чашках с агаром LB с добавлением ампициллина (400 мкг / мл), чтобы получить 500–1000 колоний на чашку. Затем были получены изображения колоний с использованием настраиваемой настройки изображения, описанной ранее (Cheng and Campbell, 2006). Для проверки яркости мутанта FlicR изображения планшетов получали с использованием фильтра возбуждения 560/40 нм и фильтра испускания 630/60 нм. Для каждого раунда случайного мутагенеза отбирали ~ 10 000 колоний (10-20 чашек).Для каждой библиотеки, созданной рандомизацией кодонов, было проверено примерно в три раза больше колоний, чем ожидаемый размер библиотеки рандомизации. Колонии с максимальной яркостью флуоресценции 0,01% отбирали вручную и культивировали в 4 мл среды LB с добавлением ампициллина (100 мкг / мл). Затем плазмиды экстрагировали с использованием набора для плазмид GeneJET miniprep (Thermo Fisher Scientific).

    Экспрессия и
    in vitro спектроскопическая характеристика FlicR1.

    Чтобы очистить FlicR1, pcDuEx0.Плазмиду 5, несущую FlicR1, использовали для трансформации электрокомпетентных клеток E. coli Dh20B (Invitrogen). E. coli выращивали на чашках с агаром LB с добавлением ампициллина (400 мкг / мл). Колонию использовали для инокуляции 8 мл жидкой среды LB (100 мкг / мл ампициллина) и выращивали в течение ночи при 37 ° C. На следующий день 8 мл бактериальной культуры добавляли к 500 мл среды LB (100 мкг / мл ампициллина) и выращивали в течение 4 часов при 37 ° C, а затем выращивали в течение 48 часов при 25 ° C. Затем осадок клеток собирали центрифугированием и лизировали суспензией в растворе B-PER (Pierce).Нерастворимую фракцию (содержащую мембранные белки) собирали после центрифугирования и ресуспендировали в растворе 2% n -додецил-β-d-мальтопиранозид (Anatrace) в трис-буферном физиологическом растворе. Затем суспензию гомогенизировали с помощью ультразвукового гомогенизатора и центрифугировали при 4 ° C. Солюбилизированный белок FlicR1 в супернатанте использовали для измерения спектра флуоресценции на планшет-ридере Safire2 (Tecan) и спектра поглощения на УФ-видимом спектрофотометре DU-800 (Beckman).

    Культура клеток.

    Клетки HeLa (CCL-2; ATCC) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS (Sigma-Aldrich), 2 мм GlutaMax (Invitrogen) и пенициллин-стрептомицин, и клетки инкубировали в течение 48 часов при 37 ° C и 5% CO 2 . Клетки разделяли и культивировали на покрытых коллагеном чашках со стеклянным дном 35 мм (Matsunami) до ~ 50% конфлюэнтности. Трансфекцию проводили путем инкубации клеток HeLa со смесью 1 мкг плазмидной ДНК и 2 мкл Turbofect (Thermo Fisher Scientific) в течение 2 часов в соответствии с инструкциями производителя.Визуализацию проводили через 24–48 ч после трансфекции.

    Клетки 293T (HEK293T) почки человека (CRL-11268; ATCC) культивировали и трансфицировали в соответствии со стандартными протоколами (Kralj et al., 2012). Вкратце, клетки HEK293T выращивали при 37 ° C и 5% CO 2 в среде DMEM с добавлением 10% FBS и пенициллин-стрептомицина. Клетки трансфицировали 400 нг ДНК с использованием Transit 293T (Mirus), следуя инструкциям производителя. Через 24 ч клетки пересаживали на чашки со стеклянным дном (D35-20-1.5-Н; In Vitro Scientific), покрытый матригелем (BD Biosciences) при плотности ~ 10 000 клеток / см 2 . Измерения проводили через 48 ч после трансфекции.

    Нейроны гиппокампа крысы.

    Глиальные монослои крыс получали аналогично Маккарти и де Веллису (1980). Вкратце, диссоциированные клетки гиппокампа от постнатальных детенышей крыс 0 (P0) любого пола (Sprague Dawley; Tocris Bioscience) (Banker and Goslin, 1998) высевали на 10-сантиметровую культуральную чашку в глиальной среде (GM), состоящей из 15% FBS. (Технологии жизни), 0.4% (мас. / Об.) D-глюкозы, 1% глутамакса (Life Technologies) и 1% пенициллина-стрептомицина (Life Technologies) в MEM (Life Technologies). После достижения слияния клетки снова высевали на чашки со стеклянным дном (D35-20-1,5-N; In Vitro Scientific), покрытые Matrigel (BD Biosciences) при плотности 3500 клеток / см 2 . Когда глиальные монослои снова достигли слияния, среду заменили GM на 2 мкМ цитарабина (цитозин-β-арабинофуранозид; Sigma-Aldrich). Чашки выдерживали в GM с 2 мкМ цитарабина до использования.

    Гиппокампы, выделенные из крысят P0, диссоциировали с использованием папаина и помещали в среду для посева (PM) при 8000 клеток / см. 2 на предварительно установленные глиальные монослои (Banker and Goslin, 1998). Через 1 день in vitro (DIV) PM заменяли на цитарабин 2 мкм в нейробазальной среде (NBActiv4; Brainbits). Затем нейроны кормили каждые 5 дней, заменяя 1 мл культуральной среды на NBActiv4 без цитарабина. Нейроны были трансфицированы на DIV 9 через фосфат кальция, как описано ранее (Jiang and Chen, 2006).Измерения на нейронах выполняли на DIV 14. Для полностью оптических электрофизиологических экспериментов на нейронах клетки котрансфицировали фосфатом кальция с каналом родопсином и ДНК FlicR1 на DIV 9 и измеряли на DIV 12–13.

    Для измерения спонтанной активности диссоциированные клетки гиппокампа E18 Sprague Dawley в полной среде гибернации EB были приобретены у BrainBits. Клетки выращивали на чашке со стеклянным дном диаметром 35 мм (In Vitro Scientific), покрытой поли-d-лизином (A-003-E; Millipore), содержащим 2 мл NbActiv4 (BrainBits) с добавлением 2% FBS, калиевой соли пенициллина-G. (25 единиц / мл) и сульфат стрептомицина (25 мкг / мл).Половину культуральной среды заменяли каждые 3 дня. Нейрональные клетки трансфицировали на 8-й день, используя Lipofectamine 2000 (Life Technologies), следуя инструкциям производителя. Вкратце, 1-2 мкг плазмидной ДНК и 4 мкл Lipofectamine 2000 (Life Technologies) добавляли к 100 мкл среды NbActive4 для получения среды для трансфекции. Затем эту среду инкубировали при комнатной температуре в течение 10–15 мин. Половину культуральной среды (1 мл) из каждой чашки нейронов извлекали и объединяли с равным объемом свежей среды NbActiv4 (с добавлением 2% FBS, калиевой соли пенициллина-G и сульфата стрептомицина) для получения смеси 1: 1. и инкубировали при 37 ° C и 5% CO 2 .Затем в каждую нейронную чашку добавляли 1 мл свежей кондиционированной (при 37 ° C и 5% CO 2 ) среды NbActiv4. Затем добавляли среду для трансфекции и нейронные чашки инкубировали в течение 2–3 ч при 37 ° C в инкубаторе CO 2 . Затем среду заменяли кондиционированной средой 1: 1, приготовленной ранее. Клетки инкубировали в течение 48–72 ч при 37 ° C в инкубаторе CO 2 перед визуализацией.

    Экранирование индуцированного трансмембранного напряжения.

    Для скрининга наведенного трансмембранного напряжения (ITV) варианты FlicR коэкспрессировались в клетках HeLa вместе с внутренним выпрямительным калиевым каналом, Kir2.1 (Addgene # 32641) и ArcLight Q239 (Addgene # 36856) в качестве внутренней ссылки. Экспрессия Kir2.1 в клетках HeLa помогает поддерживать потенциал покоя ~ -60 мВ, что подходит для скрининга индикаторов напряжения нейронов. К культуре клеток прикладывали однородное электрическое поле ~ 50 В / см для создания ITV. Генератор импульсов (PG 58A; Gould Advanced) использовался для подачи прямоугольного импульса длительностью 10 мс с частотой ~ 0,5 Гц. Усилитель (6824A 40V / 25A; Agilent Technologies) использовался для получения амплитуды импульса 25 В.Пара параллельных платиновых электродов (0,5 см друг от друга) использовалась для доставки импульсов в культуру клеток. Флуоресценцию регистрировали одновременно с несколькими импульсами электрического поля для ITV с частотой кадров 100 Гц в течение 10 с.

    Визуализация ITV в клетках HeLa.

    Визуализацию проводили в сбалансированном солевом растворе Хэнкса с буфером HEPES (25 мм) (HBSS). Инвертированный флуоресцентный микроскоп (Eclipse Ti-E; Nikon), оснащенный металлогалогенной лампой мощностью 200 Вт (PRIOR Lumen) и масляным объективом 60 ×, использовали для изображения клеток HeLa.Изображения были получены с частотой 100 Гц с биннингом 4 × 4 с использованием 16-битной ПЗС-камеры с электронным умножением QuantEM 512SC (Photometrics). Набор фильтров FITC / Cy2 (470/40 нм (возбуждение), 525/50 нм (излучение) и дихроичное зеркало 495LP (номер набора 49002; Chroma) использовался для изображения ArcLight Q239. Набор фильтров TRITC / Cy3 (545 / 30 нм (возбуждение), 620/60 нм (излучение) и дихроичное зеркало 570LP (номер набора 49005; Chroma) использовали для изображения FlicR1. Программное обеспечение NIS Elements Advanced Research (Nikon) использовалось для управления микроскопом и камерой.Необработанные флуоресцентные следы как FlicR, так и ArcLight были извлечены из идентичных интересующих областей в клетках, экспрессирующих обе конструкции, и экспортированы в настраиваемую электронную таблицу Microsoft Excel. Вычитание фона, коррекция фотообесцвечивания, вычисление среднего значения Δ F / F мин и расчет отношения сигнал / шум (SNR) выполнялись автоматически в Excel. Среднее значение Δ F / F мин и SNR сигналов FlicR сравнивали с таковыми для сигналов ArcLight от тех же ячеек, и сообщалось о соотношении Δ F / F мин FlicR по сравнению с ArcLight. .Для каждого варианта анализировали не менее 10 клеток, коэкспрессирующих FlicR и ArcLight. Был определен и секвенирован лучший вариант с максимальным средним соотношением в каждой библиотеке.

    Визуализация спонтанной активности в первичной культуре нейронов.

    Визуализацию проводили в HBSS с буфером HEPES (25 мм). Получение изображений в широком поле выполнялось на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti-E, оснащенном металлогалогенной лампой мощностью 200 Вт (PRIOR Lumen), масляными объективами 60x (числовая апертура, NA = 1,4; Nikon) и 16-битным QuantEM 512SC. ПЗС-камера с электронным умножением (Photometrics).Набор фильтров TRITC / Cy3 (545/30 нм (возбуждение), 620/60 нм (излучение) и дихроичное зеркало 570LP (# 49005; Chroma) использовали для изображения FlicR1. Частота изображения 100 Гц с биннингом 4 × 4. Необработанные следы флуоресценции были скорректированы с учетом фоновой автофлуоресценции и фотообесцвечивания. Как видно на рисунке 5 A , FlicR1 показывает некоторые внутриклеточные точки. Все больше свидетельств указывают на то, что эти структуры представляют собой лизосомы, в которых накапливается белок быстрее, чем разлагается (Катаяма и др., 2008).

    Одновременная электрофизиология и флуоресценция в клетках HEK и первичной культуре нейронов.

    Все измерения изображений и электрофизиологии были выполнены в буфере Тирода, содержащем следующие (в мм): 125 NaCl, 2,5 KCl, 3 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , 15 HEPES и 30 глюкозы, pH 7,3. Для измерения клеток НЕК добавляли 2-аминоэтоксидифенилборат (100 мкм; Sigma-Aldrich) для блокирования эндогенных щелевых соединений. Измерения при 34 ° C выполняли перфузией в буфере Тирода со скоростью 1 мл / мин при поддержании повышенной температуры с помощью встроенного нагревателя (Warner Instruments) и нагревателя объектива (Bioptechs).

    Стеклянные микропипетки с нитями (WPI) были вытянуты до сопротивления кончика 4–8 МОм и заполнены внутренним раствором, содержащим следующее (в мм): 125 глюконат калия, 8 NaCl, 0,6 MgCl 2 , 0,1 CaCl 2 , 1 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP и 0,4 Na-GTP, pH 7,3, доведенный до 295 мОсм сахарозой. Пипетки размещали с помощью манипулятора Sutter Instruments MP285. Записи целых клеток, напряжения и токовые клещи были получены с использованием усилителя Axopatch 700B (Molecular Devices), отфильтрованы на 2 кГц с помощью внутреннего фильтра Бесселя и оцифрованы с помощью платы сбора данных National Instruments PCIE-6323 на 10 кГц.Данные были получены только от ячеек с сопротивлением доступа <25 МОм. Чтобы определить минимальный ввод тока, необходимый для генерации потенциала действия перед визуализацией, вводили прямоугольные волны возрастающей амплитуды с шагом 50–100 пА во время регистрации напряжения. Минимальное значение тока, которое привело к устойчивой генерации AP, использовалось для генерации потенциалов действия для экспериментов по визуализации.

    Освещение обеспечивалось твердотельным лазером 561 нм и 100 мВт с диодной накачкой (Cobolt Jive 100 561 нм) для визуализации FlicR1 и лазером 488 нм 50 мВт (Omicron PhoxX) для визуализации ArcLight.Луч расширяли и фокусировали на заднюю фокальную плоскость масляно-иммерсионного объектива 60x (Olympus APON 60XOTIRF 1.49 NA). Интенсивность изображения на образце составляла 10 Вт / см 2 . Для полностью оптических электрофизиологических измерений в нейронах луч 488 нм был расширен и модулирован цифровым микрозеркальным устройством (Texas Instruments DLP LightCrafter Evaluation Module), управляемым с помощью встроенного программного обеспечения. Флуоресценцию FlicR1 отделяли от возбуждающего света и фильтровали с использованием дихроичного и эмиссионного фильтров из набора фильтров Cy3-4040C-OMF-ZERO (Semrock).Флуоресценцию ArcLight отделяли дихроиком с длинным проходом (каталог Semrock № FF495-Di03) и фильтровали с помощью полосового фильтра 531/40 нм (каталог Semrock № FF01-531 / 40-25). Образец был отображен на камеру EMCCD (Andor iXon + DU-860) с разрешением 128 × 128 пикселей. Для измерения скорости FlicR1 фильмы были получены с частотой кадров 2 кГц с биннингом 2 × 2. Измерения чувствительности проводились при 10 Гц без объединения. Следы фотообесцвечивания получали при 2 Гц без биннинга. Нейронные данные были получены при 1 кГц с бинингом 2 × 2 или при 500 Гц с бинингом 1 × 1.

    Часть скрининга условий полностью оптической электрофизиологии проводилась на другом специально изготовленном микроскопе, оснащенном камерой с более высоким разрешением. Освещение осуществлялось с помощью 561 нм 100 мВт Cobolt Jive (номер по каталогу 0561-04-01-0100-500), 488 нм 100 мВт Coherent Obis (номер по каталогу 1226419) или 405 нм 30 мВт Dragon Laser (номер по каталогу 11042443). Лазерные линии объединяли с дихроичными зеркалами, а интенсивность модулировали с помощью акустооптических перестраиваемых фильтров (Gooch & Housego, каталог № TF525-250-6-3-Gh28A или № 48058-2.5-.55-5W). Линия лазера 488 нм была расширена для освещения микросхемы цифрового микрозеркального устройства (Texas Instruments DLP LightCrafter с набором микросхем DLP 0.3 WVGA), которое впоследствии было повторно отображено на плоскости образца. Линии 561 и 488 нм были сфокусированы в задней фокальной плоскости объектива APON 60XOTIRF 1.49 NA (Olympus). Коллимированный лазерный свет 405 нм в задней фокальной плоскости объектива был расфокусирован для получения пятна 5 мкм на образце и направлялся в плоскости образца с помощью гальвонометрических зеркал (каталог Thorlabs # GVS202), расположенных в сопряженной плоскости.Флуоресцентный свет отделяли от освещающего света с помощью четырехзонного дихроичного зеркала (каталог Semrock № Di01-R405 / 488/561/635). Свет флуоресценции пропускали через лезвие, разделенное на два канала, с использованием дихроичного зеркала, которые рекомбинировали и повторно отображали на двух половинах чипа научной КМОП-камеры (Hamamatsu ORCA-Flash 4.0). Расщепление и рекомбинация были выполнены с использованием дихроичных зеркал (Semrock FF662-FDi01). Зеленую и оранжевую флуоресценцию фильтровали с использованием полосового фильтра HQ550 / 50m (Chroma) для возбуждения 488 нм или полосового фильтра ET595 / 50m (Chroma) для освещения 561 нм.Свет с длиной волны 458 нм обеспечивался светодиодом (LED Supply 07040-PR000-B), расположенным над образцом, отфильтрованным фильтром возбуждения D480 / 60x (Chroma) и управляемым четырехканальным светодиодным драйвером (Thorlabs DC4104). Электрофизиологические записи на этом микроскопе выполнялись, как указано выше, но с использованием усилителя Axopatch 200B и головного блока CV203BU (Molecular Devices). Сигналы фильтровались на частоте 5 кГц с помощью внутреннего фильтра Бесселя и оцифровывались на частоте 10 кГц с использованием платы сбора данных National Instruments PCIe-6259.

    Измерения кинетики ArcLightQ239 были выполнены с использованием света 488 нм от лазера Coherent Obis 488-50, сфокусированного на заднюю фокальную плоскость водно-иммерсионного объектива 60x (Olympus UIS2 UPlanSApo × 60 / 1,20 Вт, NA 1,20) до плотность энергии 2–4 Вт / см 2 на образце. Флуоресцентный свет отделяли от возбуждающего света с помощью дихроичного фильтра Semrock Di01-R405 / 488/594, пропускали через полосовой эмиссионный фильтр 525/30 и отображали на CMOS-камере для научных исследований (Hamamatsu ORCA-Flash 4.0). Регистрацию напряжения всей ячейки выполняли с помощью усилителя с фиксатором (A-M Systems Model 2400), фильтровали на частоте 5 кГц с помощью внутреннего фильтра и оцифровывали с помощью платы сбора данных PCIE-6323 National Instruments на частоте 10 кГц.

    Двухфотонная чувствительность FlicR к напряжению была протестирована на самодельном двухфотонном микроскопе со сканирующим лучом и перестраиваемым импульсным лазером с частотой 80 МГц и 100 фс (SpectraPhysics Insight DeepSee). Измерения проводились при длине волны возбуждения 1120 нм со средней по времени мощностью возбуждения 60 мВт или 0.8 нДж на импульс в режиме визуализации и ∼6 мВт или 80 пДж на импульс в режиме точечной записи. Импульсы фокусировались в пятно размером ~ 500 нм с помощью водно-иммерсионного объектива 1,2 NA (Olympus UplanSapo). Измерения изображений проводились с линейной скоростью сканирования ∼8 см / с -1 . Свет возбуждения и флуоресценция разделяли с использованием дихроичного зеркала FF775-Di01 и короткопроходного фильтра FF01-790 / SP-25 (оба – Semrock). Флуоресценцию регистрировали с помощью фотоумножителя Hamamatsu R943-02 в режиме счета фотонов, охлажденном до -20 ° C.Сигнал ФЭУ усиливался усилителем SRS PR325 и дискретизировался с помощью счетчика фотонов Hamamatsu C9744. Данные были получены с использованием карты DAQ NI pci-6259. Настройка контролировалась программным обеспечением Labview, написанным собственными силами.

    HeLa cell для всей оптической электрофизиологии.

    Визуализацию проводили в HBSS с буфером HEPES (25 мм). Использовали инвертированный флуоресцентный микроскоп (Eclipse Ti-E; Nikon), оборудованный металлогалогенной лампой мощностью 200 Вт (PRIOR Lumen) и масляным объективом 60 ×.Изображения были получены с частотой 100 Гц с биннингом 4 × 4 с использованием 16-битной ПЗС-камеры с электронным умножением QuantEM 512SC (Photometrics). Клетки, экспрессирующие только R-GECO1, R-GECO1 и ChIEF-цитрин, только FlicR1 или FlicR1 и ChIEF-цитрин, подвергались полнопольному освещению импульсами синего света (лазер 405 нм, 20 мс, 5 Гц и 10 Гц, 5 мВт / мм 2 ) для стимуляции ЧИЭФ. Клетки одновременно освещали желтым светом для возбуждения флуоресценции R-GECO1 или FlicR1. Набор фильтров TRITC / Cy3 (545/30 нм (возбуждение), 620/60 нм (эмиссия) и дихроичное зеркало 570LP (# 49005; Chroma) использовали для изображения флуоресценции R-GECO1 или FlicR1.Программное обеспечение NIS Elements Advanced Research (Nikon) использовалось для управления микроскопом и камерой. Изменения флуоресценции рассчитывали путем усреднения по всей клетке. Необработанные следы флуоресценции были скорректированы с учетом фоновой автофлуоресценции и фотообесцвечивания.

    Были исследованы различные опсины с целью минимизировать оптические перекрестные помехи с FlicR1. Интенсивность желтого света, используемая для изображения FlicR1 в клетках HeLa при скорости сбора данных 100 Гц (60 мВт / см, 2 ), намного ниже, чем интенсивность, необходимая для изображения переходных процессов AP в нейронах (10 Вт / см 2 ).Как упоминалось выше, мы использовали ChIEF в наших экспериментах по проверке концепции, потому что 60 мВт / см 2 желтого света недостаточно, чтобы вызвать активацию ChIEF. Однако нам пришлось переключиться на большее количество опсинов с синим смещением (ЦЧР и ПсЧР), чтобы попытаться избежать оптических перекрестных помех с относительно более высокой интенсивностью освещения, необходимой для изображения FlicR1 в нейронах на частоте 1 кГц (см. Рис. 8).

    Получение органотипических срезов головного мозга гиппокампа крысы.

    Горизонтальные срезы мозга (толщиной 250 мкм) крысы P0 Sprague-Dawley любого пола получали в ледяном HBSS, содержащем 1.3 мм CaCl 2 и 1 мм MgSO 4 с помощью вибрирующего микротома (Leica VT1000S), как описано ранее (Panaitescu et al., 2013). Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и с одобрения Комитета по уходу и использованию животных Университета Альберты для медицинских наук. Области гиппокампа вырезали из горизонтальных срезов головного мозга и помещали на стерильную вставку для культивирования клеток с мембраной с порами 0,4 мкм (Millipore PICMORG50). Затем вставку и срез помещали в чашку Петри, содержащую 1.5 мл NbActiv4 (BrainBits) с добавлением 5% FBS, калиевой соли пенициллина-G (50 единиц / мл) и сульфата стрептомицина (50 мкг / мл). Срезы культивировали при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 3-5 дней перед трансфекцией.

    Ex vivo электропорация органотипических срезов головного мозга.

    Вставку Millipore и культивированный на ней срез помещали между электродом из платиновой чашки Петри (CUY700-P2E; Nepa Gene) и квадратным платиновым электродом (CUY700-P2L; Nepa Gene).Зазор между чашечным электродом и мембраной заполняли буфером для электропорации (HBSS с 1,5 мМ MgCl 2 и 10 мМ глюкозы). Плазмиду pAAV2-hSyn-FlicR1 растворяли в буфере для электропорации при концентрации 1 мкг / мкл и добавляли достаточный объем, чтобы заполнить зазор между срезом и верхним электродом. Пять импульсов 20 В (5 мс каждый, 1 Гц) подавали с помощью функционального генератора (PG 58A; Gould) и усилителя (6824A; Agilent Technologies). Затем направление электрического поля было изменено на противоположное, и был применен второй набор из пяти импульсов с такими же настройками.После трансфекции срезы возвращали в инкубатор при 37 ° C с 5% CO 2 . Обычно требуется 2–3 дня для полной экспрессии FlicR1 в культивируемых срезах мозга с использованием этого метода трансфекции.

    Визуализация органотипических срезов гиппокампа крыс.

    Для получения изображения органотипических срезов головного мозга использовали вертикальный конфокальный микроскоп FV1000 (Olympus), оснащенный программным обеспечением FluoView1000 (Olympus) и водно-иммерсионным объективом 20 × XLUMPlanF1 (NA 1,00; Olympus). Освещение осуществлялось ртутной дуговой лампой мощностью 100 Вт (Olympus).

    Срез мозга на вставке Millipore был помещен в специальную камеру, чтобы удерживать его на месте во время визуализации. Непосредственно перед визуализацией срезы перфузировали суперфузатом искусственного спинномозговой жидкости (ACSF), содержащим следующее (в мм): 120 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl 2 , 2 MgSO 4 , 26 NaHCO 3 , 1,25 NaH 2 PO 4 и 10 d-глюкоза, pH доведен до 7,4 путем подачи газа 95% O 2 , 5% CO 2 при 5 мл / мин с использованием перистальтического насоса (Watson-Marlow Alitea) и температура буфера поддерживалась на уровне 34 ° C.Визуализация была начата в течение 10 минут после активации перфузионной системы.

    Для получения изображения FlicR1 срез гиппокампа возбуждали ртутной дуговой лампой мощностью 100 Вт с использованием куба-фильтра с фильтром возбуждения 565/30 нм, эмиссионным фильтром 620/50 нм и дихроичным светом 585 нм (Semrock). Изображения получали с частотой 100 Гц при биннинге 2 × 2 (см. Рис. 6 B , спонтанная активность) и 50 Гц (см. Рис. 6 E , стимулированная активность) с помощью цифровой камеры sCMOS (Hamamatsu Orca-Flash3.8). ; Hamamatsu Photonics).Для стимуляции теофиллином, примерно через 30 с после начала эксперимента, суперфузат был изменен с контрольного ACSF на ACSF, содержащий 10 мМ теофиллина (Sigma-Aldrich, непосредственно растворенный в ACSF). Приблизительно через 10 минут суперфузат был снова заменен на контрольный ACSF. Были получены изображения четырех органотипических срезов мозга, трансфицированных FlicR1, и они показали аналогичные ответы. На рис. 6 показаны репрезентативные следы флуоресценции нейронов в органотипических срезах.

    Анализ данных.

    Для измерения скорости и чувствительности в клетках HEK следы флуоресценции были извлечены с использованием алгоритма взвешивания пикселей максимального правдоподобия, описанного ранее (Kralj et al., 2012). Вкратце, флуоресценция каждого пикселя коррелировала со средней флуоресценцией всего поля. Пиксели с более сильной корреляцией со средним значением предпочтительно взвешивались при измерении флуоресценции, выделяя пиксели, содержащие больше всего информации. 5% пикселей с наивысшей корреляцией со средним значением были использованы для характеристики скорости и чувствительности белка. Флуоресцентные ответы на ступенчатые функции были усреднены по 100 испытаниям и сопоставлены с двойной экспоненциальной функцией для получения постоянных времени флуоресцентного ответа FlicR1.Чувствительность определялась как максимальное процентное изменение флуоресценции при изменении напряжения на 150 мВ.

    Следы фотообесцвечивания были получены путем вычитания средней флуоресценции области заданной пользователем области фона из средней флуоресценции заданной пользователем области клетки. Затем полученные следы были подогнаны к одной экспоненте со смещением базовой линии, чтобы получить постоянную времени фотообесцвечивания. FlicR1 показал кратковременную фотоактивацию в первые 100 с, что не учитывалось при расчетах фотообесцвечивания.

    Для измерения нейронов тело клетки и дендриты были выбраны вручную, и средняя интенсивность всех включенных пикселей была усреднена. Интенсивность фона заданной пользователем области фона была вычтена из необработанного сигнала. Базовая линия фотообесцвечивания была построена из интенсивности всего поля с помощью скользящего минимального фильтра, за которым следовал скользящий средний фильтр. Затем каждый кадр фильма корректировался путем деления на эту базовую линию. SNR рассчитывали как максимальный отклик флуоресценции на потенциал действия (как определено записью патч-кламп), деленный на стандартное отклонение базовой флуоресценции.

    Данные были проанализированы с использованием пользовательских кодов MATLAB и Microsoft Excel. График Q – Q использовался для проверки нормальности сравниваемых наборов данных. Оба набора данных были определены как имеющие одинаковую дисперсию с использованием теста F (α = 0,05). Если не указано иное, указанные значения являются средними ± SEM. Статистический метод не использовался для обоснования размеров выборки, но размеры выборки аналогичны тем, которые используются другими в этой области. Критерии отбора данных для экспериментов указаны в разделе «Материалы и методы» для каждого эксперимента и аналогичны критериям, используемым другими в этой области.

    Улучшенные индикаторы напряжения флуоресцентного белка архаэродопсина

    Abstract

    Давняя цель неврологии заключалась в разработке методов визуализации динамики напряжения генетически определенных подмножеств нейронов. Оптические датчики трансмембранного напряжения улучшили бы исследования нейронной активности в различных контекстах, от отдельных нейронов, культивируемых in vitro до популяций нейронов у бодрствующих животных. Недавние успехи определили датчики на основе архаэродопсина (Arch) как многообещающий, генетически закодированный класс флуоресцентных индикаторов напряжения, которые могут сообщать о потенциале однократного действия.Арка дикого типа демонстрирует субмиллисекундные флуоресцентные реакции на трансмембранное напряжение, но его активируемый светом протонный насос также реагирует на визуализирующее освещение. Мутант Arch (Arch-D95N) не проявляет фототока, но имеет более медленную, ~ 40 мс, реакцию на переходные процессы напряжения. Здесь мы представляем датчики напряжения, полученные из Arch, с сигналами переноса, которые усиливают их локализацию на нервной мембране. Мы также описываем мутантные датчики Arch (Arch-EEN и -EEQ), которые демонстрируют более быструю кинетику и больший динамический диапазон флуоресценции, чем Arch-D95N, и не имеют фототока при интенсивностях освещения, обычно используемых для визуализации.Мы протестировали эти датчики напряжения на предмет их точности обнаружения пиков с помощью теоретической основы обнаружения сигналов, которая учитывает экспериментально измеренный дробовой шум фотонов и формы оптических сигналов для потенциалов одиночного действия. Этот анализ показал, что за счет комбинирования мутаций последовательностей и улучшенных последовательностей трафика новые сенсоры улучшили точность обнаружения спайков почти в три раза по сравнению с Arch-D95N.

    Образец цитирования: Gong Y, Li JZ, Schnitzer MJ (2013) Улучшенные индикаторы напряжения флуоресцентного белка Archaerhodopsin.PLoS ONE 8 (6): e66959. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959

    Редактор: Филиппо Дель Бене, Институт Кюри, Франция

    Поступила: 22 марта 2013 г .; Дата принятия: 13 мая 2013 г .; Опубликовано: 19 июня 2013 г.

    Авторские права: © 2013 Gong et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Финансирование: Эта работа была поддержана программой Stanford CNC, грантом Stanford BioX Interdisciplinary Initiatives Program (IIP) и исследовательским грантом Национальной академии Keck Futures Initiative (NAKFI). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Флуоресцентные белковые индикаторы трансмембранного напряжения предлагают возможность прямого отображения динамики напряжения или пиковой активности генетически определенных типов клеток [1,2].Например, оптические эксперименты с использованием таких датчиков могут исследовать биофизическую динамику отдельных нейронов или сетевую динамику нейронных ансамблей. За предыдущие десятилетия было проведено множество оптических исследований, в которых использовались чувствительные к напряжению красители для регистрации потенциалов действия или синаптических потенциалов в отдельных нейронах или популяциях нейронов [3-5]. Маломолекулярные оптические датчики напряжения могут демонстрировать существенные сигналы (Δ F / F > 10%) и микросекундную кинетику, и, таким образом, выявляют динамику нейронов в различных условиях [5,6].Сегодня существует быстрорастущий набор генетических инструментов для анализа функции нейронной цепи, и генетически закодированный индикатор напряжения станет ключевым дополнением к этому набору инструментов. Более того, постоянная долговременная экспрессия сенсорного белка откроет возможность проведения покадровых экспериментов в течение нескольких дней или недель. Существуют гибридные подходы, которые сочетают экспрессию генетически кодируемого флуоресцентного белка с добавлением экзогенной небольшой молекулы, но они требуют применения экзогенного агента перед каждым сеансом визуализации и не используются для долгосрочной визуализации [7, 8].Генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы внутриклеточного [Ca 2+ ] уже играют важную роль в исследованиях нейробиологии, но во многих типах нейронов Ca 2+ визуализация плохо улавливает динамику всплесков. Более того, визуализация Ca 2+ обычно не дает возможности исследовать подпороговую динамику напряжения или высокочастотные всплески. Подходящие генетически закодированные датчики напряжения могут помочь исследовать такие явления, и недавние работы по созданию таких датчиков развивались по многим направлениям на основе флуоресцентных белков и микробных опсинов.

    Ранний генетически закодированный датчик напряжения использовал шейкер K + -канал в качестве чувствительного к напряжению домена (VSD), но последующая работа была сосредоточена на Ciona кишечнике VSD (Ci-VSD) [2,9]. Например, комбинация Ci-VSD и флуорофоров с красным смещением привела к созданию датчиков напряжения FRET (варианты VSFP2.x, VSFP-mUKG-mKOκ и VSFP-clover-mRuby) с кинетикой ~ 20-100 мс и превосходной чувствительностью по сравнению с известные датчики [10–15]. Другие сенсоры, основанные на pH-чувствительных доменах GFP, GFP с круговой перестановкой и гибридных доменах Ci-VSD, дали дальнейшее улучшение динамического диапазона и кинетики [16–20].Однако, несмотря на то, что сенсоры на основе Ci-VSD использовали яркие флуоресцентные белки, они еще не осознали большой динамический диапазон и быструю кинетику низкомолекулярных чувствительных к напряжению красителей (например, [3–6]). Датчики на основе Ci-VSD обычно имеют умеренный отклик (Δ F / F <3%) на нервные потенциалы действия.

    Другой недавний класс датчиков напряжения использует белки семейства родопсинов, которые содержат как чувствительный к напряжению домен, так и флуорофор.Работа над фотоциклом бактериородопсина показала, что родопсин действует как протонный насос, поглощая фотон и используя энергию для изомеризации связанного сетчатки. Последующие конформационные и электронные перестройки вызывают перенос протона изнутри клетки наружу [21,22]. Архаэродопсин-3 (Arch) структурно гомологичен бактериородопсину и качает гиперполяризационный ток при оптическом возбуждении [23].

    Начальное состояние Arch, содержащего изомеризованный ретиналь и депротонированное основание Шиффа, является чувствительным к напряжению, а трансмембранное напряжение модулирует абсорбцию как в протеородопсине, так и в Arch [24,25].Это, в свою очередь, дает модуляцию слабой флуоресценции Арка. Следовательно, флуоресценция в Arch дикого типа сообщает о динамике мембранного напряжения с субмиллисекундным временем отклика. Однако одновременный фототок, создаваемый визуализирующим освещением, может изменить функцию нейронов. Мутация Arch (D95N) устранила фототок и продемонстрировала больший динамический диапазон (~ 40% на 100 мВ), но также показала медленную кинетику с временем нарастания ~ 41 мс при комнатной температуре [25]. Эти датчики напряжения дуги также относительно тусклые, демонстрируя на два-три порядка меньший квантовый выход, чем GFP.

    Улучшение характеристик датчиков напряжения зависит от увеличения яркости, а также от реакции Δ F / F на активность напряжения, которые способствуют оптическому обнаружению [26]. Датчики без фототока из класса Ci-VSD и класса Arch демонстрируют ограниченную реакцию на потенциалы действия (Δ F / F <5%), так как их медленное время нарастания в десятки миллисекунд не позволяет датчикам воспользоваться преимуществом. их большого (установившегося) динамического диапазона (~ 40% на 100 мВ).Таким образом, более быстрая кинетика, приводящая к увеличению Δ F / F ответов на быстрые переходные процессы напряжения, могла бы значительно улучшить перспективы использования таких генетически закодированных датчиков напряжения для визуализации потенциалов действия.

    Здесь мы представляем новые флуоресцентные датчики напряжения Archaerhodopsin с более быстрой кинетикой и большим динамическим диапазоном, чем Arch-D95N. Мы также показываем, что улучшенные сигналы трафика улучшают мембранную локализацию датчиков Arch, что способствует превосходному оптическому считыванию мембранного напряжения.Затем мы описываем новые мутации Arch, которые улучшают его кинетику и динамический диапазон. Используя теорию обнаружения сигналов для анализа наших экспериментальных измерений, мы показываем, что эти улучшения дают датчик, который сообщает о потенциалах действия нейронов с точностью до ~ 3 раз большей, чем у Arch-D95N, – без фототока, индуцированного визуализирующим освещением.

    Результаты

    Усиленные мотивы трафика улучшили локализацию арочной мембраны

    В качестве первого шага в улучшении характеристик датчика напряжения мы стремились улучшить нацеливание датчика на клеточную мембрану.В первоначальном исследовании возможностей Arch в качестве датчика напряжения вычислительное взвешивание пикселей изображения было необходимо для отделения полезной флуоресцентной реакции на изменения трансмембранного потенциала от неотзывчивой фоновой флуоресценции [25]. Большая часть последней флуоресценции, вероятно, возникла из-за неправильно нацеленных молекул Arch. Используя большое оптическое увеличение и затем сильно утяжеляя пиксели на клеточной мембране, можно было в значительной степени игнорировать большинство неотзывчивых пикселей. Однако, если кто-то хочет отобразить множество клеток в широком поле зрения, эта стратегия сильного увеличения изображения каждого нейрона нецелесообразна.

    Для усиления мембранной локализации Arch сенсоров мы использовали те же мотивы трафика, которые использовались ранее с широким классом ингибирующих опсинов [27,28]. Предыдущие работы показали, что экспортная последовательность эндоплазматического ретикулума (ER) (FCYENEV) и последовательность сигнала экспорта Гольджи (TS) (KSRITSEGEYIPLDQIDINV), обнаруженные в локализованных на мембране калиевых каналах Kir2.1 [29], улучшают локализацию мембраны NpHR при добавлении к соответствующие концы белка опсина. Полученные в результате улучшенные опсины имели в 3-5 раз больший фототок, чем аналоги без мотивов трафика, с меньшим количеством внутриклеточных агрегатов [27,28,30].Хотя сообщается, что др. Экспортный мотив Kir 2.1 улучшает локализацию мембран др. Датчиков напряжения, таких как VSFP-butterfly [20], этот экспортный мотив не заметно улучшает локализацию родопсиновой мембраны в предыдущих исследованиях [28].

    Мы создали все варианты Arch, обсуждаемые в этой статье, в рамках аналогичной конструкции, содержащей промотор CaMKIIα ( Camk2a ) и посттранскрипционный регуляторный элемент сурьевого гепатита (WPRE) (рис. 1а). В нейронах, трансфицированных конструкциями, содержащими сигналы трафика, сигналы флуоресценции YFP и Arch, как правило, локализованы на мембране, что указывает на минимальную внутриклеточную агрегацию (рис. 1b).

    Рис. 1. Спектры флуоресценции и мембранная локализация усиленных конструкций Arch.

    ( a ). Мы экспрессировали усиленные конструкции Arch (версии EEQ и EEN) в виде слияния с eYFP под контролем промотора Camk2a и направили слитый белок на клеточную мембрану с использованием последовательностей локализации TS и ER. ( b ) Сигналы флуоресценции от меченого нейрона, как видно в каналах флуоресценции YFP ( слева, ) и Arch-EEN (, средний ), вместе с нормализованной пространственной картой ( справа ) флуоресцентного ответа на ступенчатая деполяризация напряжения.Области, в которых была видна флуоресценция YFP, также обычно проявляли ответы Arch на деполяризацию напряжения, что свидетельствует об успешном нацеливании на мембрану. Масштабная линейка составляет 20 мкм. ( c ) Спектры поглощения и флуоресценции Arch-EEN. Спектры Arch-EEQ аналогичны.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959.g001

    Мы применили протокол ступенчатого напряжения к нейронам, экспрессирующим варианты Arch, в то время как мы отслеживали эмиссию флуоресценции (методы).Чтобы качественно оценить степень локализации мембраны, мы вычислили изменения интенсивности флуоресценции Δ F / F по всем изображениям (рис. 1b). Пиксели с наибольшими значениями Δ F / F были расположены на внешних краях изображения ячейки, но мы также наблюдали существенные значения Δ F / F для пикселей внутри ячейки. Эти пиксели включали сигналы флуоресценции от частей клеточной мембраны, которые находились за пределами фокальной плоскости, но из которых мы, тем не менее, улавливали флуоресцентное излучение из-за отсутствия оптических секций.Как и ожидалось, внутренние пиксели показали более низкую интенсивность излучения, но лишь умеренно более низкие значения Δ F / F , чем пиксели на внешних краях ячеек. Эти наблюдения указывают на то, что сигналы трафика улучшают локализацию мембран и снижают нечувствительную к напряжению агрегацию белков Arch в теле клетки. Учитывая эту улучшенную локализацию, мы сгруппировали пиксели до гораздо более низкого разрешения, чем в предыдущих исследованиях, ранжировали пиксели на основе их отношения сигнал / шум (SNR) и выбрали достаточное количество пикселей для покрытия сомы ячейки (методы).Такой крупнозернистый анализ совместим с исследованиями изображений в большом поле зрения, сохраняя при этом динамический диапазон экспериментально измеренных значений Δ F / F .

    Мутанты Arch демонстрировали более высокую кинетику и больший динамический диапазон, чем Arch-D95N

    Чтобы повысить чувствительность Arch к напряжению, мы использовали обширную литературу о том, как мутации белков влияют на фотоцикл бактериородопсина. Используя гомологию между бактериородопсином и Arch в их аминокислотных последовательностях, мы отметили, что процесс протонной перекачки перемещает протон через позиции D95, D222, E214 и D106 в Arch [31–33].Депротонирование основания Шиффа и передача заряда в положение D95 является первым этапом транслокации протона фотоцикла. Репротонирование основания Шиффа с помощью заряда, передаваемого из позиции D106, является последним шагом [21,22]. Поскольку эти два шага являются ключевыми для модуляции зарядового состояния основания Шиффа и, следовательно, поглощения и флуоресценции, мы рассмотрели мутации в этих положениях для повышения чувствительности Арка к напряжению.

    Мутация аминокислоты D95 на незаряженную аминокислоту является общим способом устранения фототока [25,31–33].Помимо вышеупомянутой мутации D95N, мутации D95S и D95T в гомологичном положении в бактериородопсине привели к току Cl , который не принесет пользы при визуализации напряжения [34]. В недавних сообщениях мутация бактериородопсина, гомологичного D95Q, также устраняла фототок [35]. Мы исследовали эту мутацию в Arch. При экспрессии в клетках HEK эта мутация давала 50% Δ F / F на 100 мВ изменения мембранного напряжения и отсутствие фототока, но она также демонстрировала медленную кинетику со временем включения ~ 70 мс, во многом как Arch-D95N.

    Мутации в положениях, гомологичных Arch-D106 в бактериородоспине, также модифицировали фотоцикл. Поскольку D106 служит донором основания Шиффа во время стадии репротонирования, замена D106 на незаряженную аминокислоту замедляет фотоцикл и снижает фототок [33]. Первоначально мы использовали мутацию D106N в Arch в надежде уменьшить фототок, но мутант продемонстрировал значительный фототок без чувствительности к напряжению (данные не показаны). Это наблюдение предполагает, что D106 является основным каналом для протонирования и депротонирования электронов чувствительного к напряжению основания Шиффа во время модуляции мембранного напряжения.Таким образом, мутация аспарагиновой кислоты в гомологичную глутаминовую кислоту может сдвигать относительную pK a между положением D106 и основанием Шиффа, изменяя кинетику протонирования и депротонирования. Эта комбинация наблюдений за позициями D95 и D106 привела нас к испытанию двойных мутаций D95N-D106E (Arch-EEN) и D95Q-D106E (Arch-EEQ).

    Спектрально, два мутанта Arch (которые мы будем называть Arch-EEx, когда будем обращаться к ним обоим) похожи на Arch-D95N как по поглощению, так и по испусканию (рис. 1c).Arch-EEx имел больший динамический диапазон, чем Arch-D95N, в ответ на различные формы сигналов напряжения и тока (методы). Сначала мы сравнили ступенчатую реакцию Arch-D95N, Arch-EEN и Arch-EEQ в нейронах при низкой частоте кадров 440 Гц (рис. 2а). Затем мы исследовали начальный рост формы оптической волны каждого мутанта путем визуализации с высокой частотой кадров (1000 Гц) отклика флуоресценции на деполяризацию напряжения от -70 мВ до +30 мВ (рис. 2b). Мутация D106E дала быструю кинетику как для мутаций D95N, так и для D95Q, что привело к времени нарастания ~ 5-15 мс с точностью до 1/ e от полного ответа по сравнению с ~ 45 мс для Arch-D95N (методы).Мы также наблюдали быстрый компонент роста флуоресценции как для Arch-EEN, так и для Arch-EEQ. Этот быстрый компонент улучшил Δ F / F в ответ на потенциалы действия, как описано ниже. Мы усреднили установившееся состояние Δ F / F как функцию приложенного напряжения (рис. 2c) и обнаружили, что Arch-EEQ превзошел Arch-D95N, достигнув 60% Δ F / F на 100 мВ. Arch-EEN уступал Arch-D95N в этом отношении, давая только 20% Δ F / F на шаг напряжения 100 мВ.

    Рис. 2. Варианты с улучшенной аркой быстрее реагируют на деполяризацию напряжения и имеют больший динамический диапазон.

    ( a ) Оптические ступенчатые ответы нейронов, трансфицированных Arch-D95N, Arch-EEN и Arch-EEQ, отображаемые с частотой 440 Гц. Мы удерживали нейроны на уровне -70 мВ в начале каждой кривой и переходили к командному напряжению в диапазоне от -140 мВ до +100 мВ. ( b ) Оптическая ступенчатая реакция конструкций Arch, выраженная в нейронах при повышении напряжения с -70 мВ до +30 мВ, нормализованная к максимальной ступенчатой ​​реакции каждого датчика и отображаемая в более коротких временных масштабах, чем в ( a ), отображенная на 1000 Гц.( c ) Устойчивый флуоресцентный ответ конструкций Arch как функция мембранного напряжения. ( d ) Arch-WT генерировал заметный фототок при освещении 633 нм (пурпурные полосы), тогда как Arch-EEQ генерировал незначительный фототок. ( и ) Установившиеся фототоки различных конструкций Arch в ответ на одно и то же освещение 633 нм. Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего (s.e.m). Интенсивность освещения на образце составляла 1400 мВт / мм 2 для всех панелей.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959.g002

    Поскольку Arch дикого типа генерирует ингибирующий фототок, который изменяет функцию нейрона, мы также проверили, производят ли новые мутанты какой-либо фототок. Мы наблюдали значительный фототок для нейрона, трансфицированного Arch дикого типа во время применения возбуждающего лазера при той же интенсивности освещения (1400 мВт / мм 2 ), используемой во время визуализации (рис. 2d). Однако в идентичных оптических условиях мы зарегистрировали небольшой фототок для нейрона, трансфицированного Arch-EEQ.Усредняя измеренный фототок по множеству ячеек, мы наблюдали незначительный фототок как для Arch-EEN (-0,1 пА ± 0,1 пА, n = 10 ячеек), так и Arch-EEQ (0,2 пА ± 0,1 пА, n = 16 ячеек. ) (Рис. 2д).

    Более быстрая кинетика мутантов Arch-EEx также улучшила флуоресцентные ответы на потенциалы действия нейронов. Типичные оптические кривые (частота кадров 440 Гц) хорошо соответствовали одновременно зарегистрированным следам электрической активности в отношении как пиков, так и подпороговой динамики (рис. 3а).Примечательно, что компоненты быстрого и медленного отклика датчиков Arch-EEx выполняли разные функции. Быстрый компонент облегчает обнаружение пиков, тогда как комбинация быстрого и медленного компонентов передает колебания базового напряжения. Мы вычислили Δ F / F отдельных нейронов в ответ на одиночные потенциалы действия, индуцированные короткими токами инъекции (рис. 3b-c). Электрофизиологические записи для клеток, экспрессирующих Arch-EEQ, -EEN и -D95N, соответственно показали ширину потенциала действия на полувысоте 3.5 ± 0,8 мс, 3,4 ± 0,6 мс и 3,1 ± 0,8 мс (среднее ± стандартное отклонение; n = 7–23 клетки) (рис. 3b), которые являются типичными значениями для культивируемых нейронов. Из-за своей более быстрой кинетики Arch-EEN продемонстрировал ~ 3-кратное увеличение пика Δ F / F в ответ на нервные спайки по сравнению с Arch-D95N, несмотря на уменьшенный стационарный динамический диапазон Arch-EEN. Точно так же Arch-EEQ имел 4-кратное увеличение пикового ответа Δ F / F на спайки по сравнению с Arch-D95N, со значениями Δ F / F до 17% для отдельных клеток.Вероятно, что улучшенный выбор пикселей и вычитание фона могут дать еще более высокие значения Δ F / F .

    Рис. 3. Датчики Enhanced Arch сообщают о потенциалах одиночного действия с большей пиковой амплитудой, чем Arch D95N.

    ( a ) Следы флуоресценции нейрона, экспрессирующего Arch-EEQ ( вверху, ), и нейрона, экспрессирующего Arch-EEN ( внизу, ), показали острые пики, соответствующие потенциалам действия при одновременных электрофизиологических измерениях.( b ) Средние формы оптических сигналов (среднее значение n = 20, 20 и 12 кривых для кривых EEQ, EEN и D95N, соответственно) отклика датчиков Arch ( верхних ) имели аналогичную форму усредненная форма электрического сигнала отдельных потенциалов действия ( дно, n = 20 кривых). ( c ) Средние пиковые ответы на единичные потенциалы действия для Arch-D95N ( n = 7 клеток), Arch-EEN ( n = 20 клеток) и Arch-EEQ ( n = 23 клетки).Планки погрешностей – s.e.m. Частота визуализации флуоресценции составляла 440 Гц, а интенсивность освещения составляла 1400 мВт / мм 2 для всех панелей.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959.g003

    Мутации дуги улучшили точность обнаружения спайков

    Мы охарактеризовали новые мутанты Arch, используя различные меры SNR и возможности обнаружения спайков, и обнаружили, что датчики превзошли Arch-D95N. Упрощенное понятие SNR – это пиковый отклик, деленный на стандартное отклонение базовой флуоресценции в одном временном интервале (методы).Мы сравнили ограниченные дробовым шумом характеристики различных датчиков, используя этот показатель, все в одних и тех же условиях визуализации (частота кадров 440 Гц; освещение 1400 мВт / мм 2 ) (рис. 4a). Из-за одинаковой яркости всех трех мутантов при возбуждении 633 нм, новые мутанты Arch имели аналогичные увеличения SNR, как это было предсказано на основании увеличения ответов пика Δ F / F .

    Рис. 4. Датчики Enhanced Arch превзошли Arch-D95N по нескольким параметрам, характеризующим обнаружение нейрональных спайков.

    ( a ) Пик Δ F / F – значения оптических откликов на потенциалы действия, построенные как функция средней скорости излучения фотонов (F 0 ) в течение базовых периодов, как определено из экспериментальных форм оптических сигналов. . Пунктирные линии представляют изоконтуры отношения сигнал / шум во время пика излучения, определенного как отношение пиковой характеристики к стандартным отклонениям в базовом дробовом шуме, (ΔF / F) × F0 / ν. Arch-EEQ превзошел Arch-D95N примерно в 4 раза, а Arch-EEN превзошел Arch-D95N примерно в 3 раза.( b ) Пик Δ F / F значений оптических откликов на потенциалы действия, нанесенных на график как функция расчетного общего числа фотонов, детектированных на спайк. Пунктирные линии представляют собой изоконтуры точности обнаружения спайков, d ’, как определено в Wilt et al. 2012 и определено на основе экспериментально измеренных форм оптических сигналов. Arch-EEQ превзошел Arch-D95N примерно в 2,8 раза. ( c ) Усовершенствованные датчики Arch позволили увеличить продолжительность экспериментальной визуализации сверх минимальных значений точности обнаружения.Для экспериментов, которые начинаются с начального значения d ’, сплошными линиями показано общее время визуализации ( T ), которое датчики могут обеспечить точность обнаружения пиков> d / e . Для показанного начального значения d ’, Arch-EEQ обеспечил общую длительность визуализации на порядок больше, чем у Arch-D95N. Мы получили все данные изображений при частоте кадров ν = 440 Гц и интенсивности освещения 1400 мВт / мм 2 . Все точки данных представляют собой среднее значение ± s.Эм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959.g004

    Мы также использовали теоретическую основу обнаружения сигналов для количественной оценки точности обнаружения всплесков [26]. Дискриминируемость спайков, описанная в [5]. 26, обозначенная здесь как d ‘, индексирует кривую рабочей характеристики приемника (ROC) для обнаружения всплесков и количественно определяет степень, в которой выбросы могут быть правильно идентифицированы в данных флуоресценции, достигаемых в пределах физического шума, установленного дробовым шумом фотонов (Методы ).Этот показатель качества учитывает экспериментально определенный базовый уровень флуоресценции нейрона, пик Δ F / F , ответ на спайк, и временную продолжительность реакции сенсора на спайк. Агрегируя фотоны по нескольким кадрам и учитывая кинетику сенсора, эта структура обеспечивает гораздо более реалистичную меру точности обнаружения всплесков, чем более традиционные, упрощенные измерения SNR, такие как показанные на рис. 4a .

    Чтобы сравнить различимость спайков, мы объединили на одном графике изоконтуры d ’, значения пика датчика Δ F / F и общее количество фотонов, агрегированных во флуоресцентном переходном процессе (рис. 4b).Несмотря на меньшее пиковое значение Δ F / F Arch-D95N, медленная кинетика Arch-D95N обеспечила частичную компенсацию при сравнении его значения d ’ с таковыми у Arch-EEx; Более медленная кинетика Arch-D95N приводила к более длительным переходным процессам, которые увеличивали общее количество фотонов, связанных с потенциалами действия. Однако Arch-EEQ и Arch-EEN по-прежнему превосходили Arch-D95N в 2,8 и 2,0 раза при d ’соответственно.

    Еще один способ оценить эффективность датчиков напряжения – сравнить общую продолжительность, в течение которой они позволяют надежно обнаруживать всплески напряжения, прежде чем подвергнуться фотообесцвечиванию.Мы определили эту продолжительность, T , для различных датчиков Arch, исследуя кинетику фотообесцвечивания (рис. 4c) (методы). Увеличение интенсивности освещения улучшает d ’ за счет увеличения скорости испускания фотонов, но также снижает T за счет ускорения фотообесцвечивания. Мы охарактеризовали этот компромисс между d ’ и T при различной интенсивности освещения, определив постоянную« фотонную емкость »для каждого датчика как произведение времени фотообесцвечивания датчика и начальной скорости излучения фотонов (рис. 4c).Поскольку d ’ пропорционален пику Δ F / F , любое улучшение последнего может привести к соответствующему процентному увеличению T , если уменьшить интенсивность освещения для достижения фиксированного значения d’ . Значение T для Arch-EEQ было на порядок больше, чем для Arch-D95N, при любом фиксированном d ’ (рисунок 4c).

    Arch совместим с мультиспектральным возбуждением и формированием изображений

    Спектр поглощения и флуоресценции Arch со смещением в красную область был совместим с одновременным возбуждением других белков голубым или зеленым светом.Мы использовали линкер 2A, который позволяет двум частям бицистронной последовательности экспрессироваться как отдельные молекулы белка, нарушая трансляцию белка в положении линкера 2A [36,37]. Этот подход позволил нам экспрессировать Arch-EEQ вместе с другим представляющим интерес белком в том же наборе клеток. Полипептидные линкеры и последовательности IRES также обеспечивают экспрессию двух белков с использованием только одной конструкции либо в слитой, либо в раздельных формах. Однако линкер 2A обеспечивает стехиометрическую экспрессию, но различные паттерны локализации для двух видов белков, поскольку каждый белок сохраняет свои собственные мотивы переноса [36,37].В качестве иллюстраций, используя саморасщепляющийся линкер p2A, мы создали конструкции, которые одновременно экспрессируют Arch с ChR2 [38] и GCaMP5 [39]. Предыдущие работы показали, что конструкция NpHR-2A-ChR2 дает как значительный возбуждающий, так и тормозной ток, в зависимости от длины волны возбуждения, и что множественные мембранные белки могут экспрессироваться в одной клетке [28].

    Во-первых, мы сделали конструкцию Arch-EEQ-2A-hChR2, чтобы обеспечить одновременный оптический контроль и считывание нейронного напряжения (рис. 5а). При таком же освещении, как указано выше, мы одновременно визуализировали датчик Arch (возбуждение 633 нм; 1400 мВт / мм 2 ) и деполяризовали нейрон (голубые полосы; возбуждение 488 нм; 4 мВт / мм 2 ) (рис. 5b).Электрические записи подтвердили, что во время стимуляции голубым цветом возникали потенциалы действия. Во-вторых, мы создали конструкцию Arch-EEQ-2A-GCaMP5 для одновременного считывания напряжения нейрона и динамики кальция (рис. 5c). Arch был локализован на мембране, тогда как экспрессия GCaMP5 была цитозольной, как и ожидалось с этой конструкцией (рис. 5d). Этот сегрегированный образец локализации может облегчить разделение сигналов от двух каналов флуоресценции. Мы запускали потенциалы действия, вводя короткие импульсы тока, и одновременно наблюдали за последующим напряжением и динамикой кальция (рис. 5e).Поскольку некоторые из импульсов тока не инициировали потенциалы действия, они вызывали только подпороговую деполяризацию напряжения в мембранном потенциале (методы). Кривая флуоресценции Arch сообщала об этих подпороговых событиях (оранжевые маркеры), а кривая флуоресценции GCaMP5 – нет.

    Рисунок 5. Бицистронные конструкции, экспрессирующие Arch-EEQ с помощью ChR2 или GCaMP5, позволяющие визуализацию напряжения в сочетании с оптогенетическим контролем или визуализацией кальция.

    ( a ) Схема конструкции Arch-2A-hChR2.( b ) Конструкция Arch-2A-hChR2 обеспечивала полностью оптическую стимуляцию и считывание нейронов. Мы визуализировали нейроны, трансфицированные конструкцией Arch-2A-hChR2, и одновременно измеряли трансмембранный потенциал (черный график) и флуоресценцию Arch (синий график). Фотовозбуждение ChR2 (горизонтальные голубые полосы; λ = 488 нм, 4 мВт / мм 2 ) вызывало всплески как в оптических, так и в электрических измерениях. ( c ) Схема конструкции Arch-2A-GCaMP5. ( d ) Мы наблюдали нейроны, трансфицированные конструкцией Arch-2A-GCaMP5, одновременно визуализируя флуоресценцию GCaMP5 (зеленый канал, локализованный цитозоль) и флуоресценцию Arch (красный канал, локализованная мембрана).Масштабная линейка составляет 20 мкм. ( e ) Конструкция Arch-2A-GCaMP5 позволяла одновременно измерять напряжение (синий график) и внутриклеточный кальций (зеленый график). Хотя потенциалы действия были очевидны как в сигналах Arch, так и в сигналах GCaMP5 (черные треугольные маркеры на кривой GCaMP5; λ = 488 нм возбуждение, I = 10 мВт / мм 2 ), сигналы Arch были намного лучше в представлении кратких, суб -пороговая деполяризации (оранжевые кружки на следе дуги). Частота визуализации флуоресценции составляла 440 Гц, а интенсивность освещения для возбуждения дуги (возбуждение λ = 633 нм) составляла 1400 мВт / мм 2 для всех панелей.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066959.g005

    Обсуждение

    Мы представили датчик напряжения Arch, который превосходит ранее опубликованную версию в 2,8 раза на d ’. Прямое сравнение с другими классами генетически закодированных датчиков напряжения (в основном на основе вариантов GFP) затруднено, поскольку каждый класс датчиков имеет разные длины волн возбуждения и излучения и испытывается при разных уровнях мощности возбуждения.Эти три фактора влияют на уровень фоновой флуоресценции, оптического рассеяния и фототоксичности, которые являются важными параметрами, которые следует учитывать при использовании датчиков напряжения в срезах мозга и препаратах живых животных.

    Хотя датчики напряжения на основе Ci-VSD показали большие установившиеся значения Δ F / F (40% на 100 мВ), медленное время нарастания имеет ограниченные оптические отклики на пики до ~ 3% изменений флуоресценции. В срезах мозга и in vivo препаратах фоновая эмиссия и аутофлуоресценция намного более значительны, чем в культивируемых нейронах, вызывая дальнейшую деградацию используемых сигналов.Мощность возбуждения в десятки мВт / мм 2 необходима для обнаружения всплесков с d ’> 10, что требует серьезного компромисса между наличием достаточного сигнала и предотвращением фотообесцвечивания. Поскольку датчики напряжения на основе Ci-VSD, как правило, уже имеют флуорофоры с высоким квантовым выходом (> 10%), прикрепленные к VSD, вероятно, что для этого класса датчиков потребуется улучшение эффективного пика Δ F / F . улучшить визуализацию напряжения одиночных спайков в срезе мозга или in vivo , либо за счет улучшения SNR, либо за счет уменьшения необходимых уровней освещенности.

    Для сравнения, Arch страдает низким квантовым выходом, но имеет значительный пиковый отклик Δ F / F . Плотности мощности возбуждения, используемые здесь с Arch, позволяют проводить исследования отдельных клеток в культуре, но не позволяют легко получить широкопольное флуоресцентное изображение в срезах мозга, для которых высокая интенсивность освещения, вероятно, приведет к значительной фоновой автофлуоресценции. Фактически, в исследованиях с использованием электропорации in utero с конструкциями Arch уже сообщалось, что сигналы флуоресценции были незначительными по сравнению с фоновой автофлуоресценцией [2].Таким образом, исследователи должны улучшить низкий квантовый выход Arch, либо путем прямой мутации хромофора Arch, либо с помощью косвенных подходов, таких как использование возбуждения FRET. Независимо от эмиссионных свойств Arch, мы показали, что Arch обнаруживает переходные процессы напряжения с относительно большим динамическим диапазоном и быстрой кинетикой по сравнению с существующими датчиками напряжения флуоресцентных белков и, таким образом, служит жизнеспособной альтернативой Ci-VSD в качестве домена, чувствительного к напряжению.

    Датчики напряжения, вероятно, будут играть иную роль, чем датчики кальция в нейробиологических исследованиях.Самые последние генетически закодированные сенсоры кальция приближаются к надежной чувствительности к единичным пикам, хотя их медленная кинетика ограничивает их обнаружением временно разреженных потенциалов действия [39]. Тем не менее, эта форма обнаружения спайков может быть достаточной для изучения динамики редких спайков в важных классах клеток, таких как пирамидные нейроны неокортекса. Генетически закодированные датчики напряжения могут найти нишевые приложения при изучении динамики быстрых всплесков, подпороговых или популяционных уровней в генетически определенных типах нейронов, все из которых датчики кальция плохо сообщают [40].Многие нейронные сети содержат тормозящие нейроны с быстрым выбросом, которые регулируют подпороговые напряжения других клеток, что приводит к богатым классам колебательной активности. Как показали наши одновременные исследования напряжения и визуализации кальция, датчики напряжения с достаточно быстрой кинетикой (время нарастания <10 мс) и большим Δ F / F (50% на 100 мВ) могут обнаруживать подпороговую активность, которую упускает кальций. датчики. Таким образом, визуализация быстрых всплесков и подпороговой динамики с использованием датчиков напряжения нового поколения может способствовать пониманию возбуждающе-тормозного баланса и колебательных явлений в сетях.

    Методы

    Заявление об этике

    Административная комиссия Стэнфордского университета по уходу за лабораторными животными (APLAC) одобрила все эксперименты на животных.

    Арочные конструкции

    Arch мутантов произошли от Arch-GFP (плазмида Addgene 22217). Мы сконструировали Arch-EEN, Arch-EEQ и улучшили Arch-D95N с помощью сайт-направленного мутагенеза в Arch и последующей сборки перекрытия с eYFP и сигналами трафика. Мы удалили часть eYFP конструкции Arch-EEQ при создании конструкций Arch-2A.Варианты Arch депонированы на Addgene в виде плазмид 45188 (Arch-EEQ) и 45189 (Arch-EEN).

    Первичная культура клеток

    Мы препарировали клетки гиппокампа крыс от детенышей Sprague-Dawley (постнатальный день 0, Charles-River Labs) и культивировали их в нейробазальной среде (Invitrogen) с добавлением глутамина и B27 (Invitrogen) [41]. Мы трансфицировали мутантную плазмидную ДНК Arch с использованием фосфата кальция через 3–5 дней после посева и визуализировали нейроны через 3–5 дней после трансфекции.

    Электрофизиология

    Мы одновременно получили измерения флуоресценции и измерения напряжения или тока при 22 ° C, удерживая нейроны в перфузионной камере, установленной на предметном столике микроскопа. Внеклеточный раствор содержал 150 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 2 мМ CaCl 2 и 2 мМ MgCl 2 . Внутриклеточный раствор содержал 129 мМ К-глюконат, 10 мМ KCl, 10 мМ HEPES и 4 мМ Na 2 АТФ.Мы вытащили патч-пипетки из боросиликатного стекла с сопротивлением 3-6 МОм (Sutter Instruments P-97), что обеспечило сопротивление доступа 5-25 МОм в режиме целой ячейки.

    Мы пропатчили нейроны с помощью усилителя Axopatch 700B (Axon Instruments) и использовали программное обеспечение pClamp (Axon Instruments) для генерации различных сигналов управления и записи кривых напряжения и тока. Форма сигнала управления напряжением применяет удерживающий потенциал -70 мВ в начале каждого цикла, а затем применяет шаги продолжительностью 1 с к напряжениям в диапазоне от -140 мВ до +100 мВ с шагом 20 мВ.Для создания потенциалов действия в токовых клещах мы подавали ток как с использованием длинных импульсов (10–200 пА;> 0,5 с), так и коротких импульсов (300-1000 пА; 2 мс). Короткие импульсы тока вызывали пики с эффективностью, близкой к единице, при настройке выше порога пиков и запускали пики с эффективностью ~ 50%, когда они были близки к порогу пиков. Мы скорректировали post hoc напряжение мембраны с учетом потенциала перехода и сопротивления доступа.

    Флуоресцентная визуализация

    Мы использовали эпифлуоресцентный микроскоп (Olympus IX51) с 40 × 0.Водный иммерсионный объектив 8 NA для покадровой съемки. Мы использовали светодиод с длиной волны 480 нм (89 North Heliophore) или гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм; эти источники прошли через фильтр возбуждения 475/25 нм или 620/40 нм для возбуждения GFP / GCaMP / YFP и Arch соответственно. Мы визуализировали все следы флуоресценции Arch, используя освещение 1400 мВт / мм 2 в плоскости образца. Эмиссия флуоресценции проходила через дихроичное зеркало 495 нм и длиннопроходный эмиссионный фильтр для визуализации GFP / GCaMP / YFP, но через дихроичное зеркало 645 нм и эмиссионный фильтр 697/75 нм для Arch.В экспериментах с двумя цветами использовались четырехдиапазонный фильтр возбуждения 405/488/561/635 нм (Semrock) и делитель излучения DualView (Optical Insights). Последний разделяет зеленое излучение и излучение дуги с помощью дихроичного зеркала 565 нм; два результирующих канала флуоресценции имели фильтры излучения 535/50 нм и 697/75 нм соответственно. Камера устройства с электронным умножением и зарядовой связью Andor iXon 897, охлаждаемая до -80 ° C, записывала излучение на частоте 400–1000 Гц с использованием разделенных пикселей размером 3 мкм × 3 мкм (или больше) в плоскости изображения для достижения скорости получения изображения. .

    Определение карт ΔF / F

    Мы вычислили Δ F / F карт как разницу между средней флуоресценцией с приложенным шагом напряжения и без него для каждого пикселя. Мы ранжировали пиксели в соответствии с их SNR, определенным здесь как (ΔF / F) × F¯, где Δ F / F – это изменение нормализованной флуоресценции при приложении шага напряжения, а F¯ – средняя флуоресценция пикселя для весь след. Затем мы суммировали флуоресценцию от верхних 20% пикселей изображения, чтобы получить временные кривые флуоресценции для дальнейшего анализа.Этого подмножества пикселей было достаточно, чтобы покрыть сому клетки.

    Спектры поглощения и излучения

    Мы получили спектры поглощения и излучения путем переноса мутантов Arch в плазмиды с промотором CMV и трансфекции клеток HEK в общем объеме 100 мл в течение 3 дней. Мы добавили полностью транс-ретиналь (5 мкМ) и культивировали клетки в темноте в течение 3 часов. Мы осаждали клетки, лизировали их с помощью ультразвукового устройства в 50 мМ Трис с 2 мМ MgCl 2 при pH 7,3 и снова осаждали.Наконец, мы гомогенизировали лизат в PBS (pH 7,2) с добавлением 1,5% додецилмальтозида и осаждали еще раз. Спектр поглощения был получен с использованием супернатанта и спектрофотометра (Tecan Safire 2 UV – Vis). Мы получили спектр излучения, используя ту же самую установку визуализации для экспериментов с заплатами, спектрометр (Thorlabs CCS200) и возбуждение 633 нм.

    Определение скорости фотообесцвечивания и фотонной емкости

    Мы повторно использовали те же самые следы в экспериментах с патч-зажимом для определения количества фотонов и времени затухания обесцвечивания, из которых мы вычислили общее количество фотонов, испускаемых клеткой до фотообесцвечивания.Выполнив экспоненциальную подгонку к периодам покоя на следах флуоресценции без электрофизиологических манипуляций, мы определили постоянную времени фотообесцвечивания для каждого следа. Мы рассчитали фотонную емкость как произведение начальной скорости испускания фотонов и времени фотообесцвечивания (9).

    Определение точности обнаружения пиков

    Поскольку мы отображали все образцы Arch с одинаковой интенсивностью освещения ( I = 1400 мВт / мм 2 ), мы смогли напрямую сравнить скорости излучения фотонов различных датчиков.Сначала мы определили SNR для обнаружения всплесков в оптической трассе, ограниченной дробовым шумом, как SNR = (ΔF / F) × F0 / ν, где F 0 – скорость излучения фотонов для нейрона, а ν – частота дискретизации данных. . Этот SNR представляет собой пиковый отклик Δ F , деленный на стандартное отклонение базовой линии (F0 / ν). Мы также вычислили изоконтуры отношения сигнал / шум, используя это соотношение.

    Кроме того, мы использовали структуру обнаружения сигналов для вычисления параметра различимости пиков, d ’(20).Это характеризует точность обнаружения пиков сенсора таким образом, что учитываются как продолжительность, так и интенсивность сигнала флуоресценции в ответ на потенциалы действия. Мы использовали экспериментальные определения средней интенсивности флуоресценции и средней формы волны флуоресценции в ответ на единичные потенциалы действия (например, рисунок 3b) для вычисления d ’. Мы вычислили изоконтуры d ‘, аппроксимируя переходные процессы флуоресценции как моноэкспоненциальные затухания и вычислив начальное значение d’ из Δ F / F и предполагаемое общее количество фотонов в переходном процессе (20 ).Для экспериментов с начальным значением d ’мы определили время визуализации ( T ) как общую экспериментальную продолжительность, в течение которой датчик обеспечивает точность обнаружения пиков> d / e .

    Благодарности

    Авторы благодарят Янпин Чжан за помощь с протоколом экстракции белка и Эми Лам из лаборатории Майкла Линя за помощь в проведении спектроскопических измерений.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: YG MJS.Проведены эксперименты: Ю.Г. Проанализированы данные: Ю.Г. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YG JZL. Написал рукопись: YG JZL MJS. Готовые конструкции датчика: YG JZL.

    Список литературы

    1. 1. Петерка Д.С., Такахаши Х., Юсте Р. (2011) Напряжение изображения в нейронах. Нейрон 69: 9–21. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.neuron.2010.12.010. PubMed: 21220095.
    2. 2. Mutoh H, Akemann W, Knöpfel T (2012) Генетически сконструированные флуоресцентные репортеры напряжения.Acs Chem Neurosci 3: 585-592. DOI: https: //doi.org/10.1021/cn300041b. PubMed: 22896802.
    3. 3. Гринвальд А., Хильдесхайм Р. (2004) VSDI: новая эра в функциональной визуализации корковой динамики. Nat Rev Neuro 5: 874-885. DOI: https: //doi.org/10.1038/nrn1536. PubMed: 15496865.
    4. 4. Chemla S, Chavane F (2010) Визуализация чувствительного к напряжению красителя: обзор техники и модели. Журнал Физиол Париж 104: 40-50. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jphysparis.2009.11.009. PubMed: 19

      9.

    5. 5. Зальцберг Б.М., Гринвальд А., Коэн Л. Б., Давила Х. В., Росс В. Н. (1977) Оптическая запись нейронной активности в центральной нервной системе беспозвоночных: одновременный мониторинг нескольких нейронов. J Neurophysiol 40: 1281-1291. PubMed: 925730
    6. 6. Зальцберг Б.М., Обейд А.Л., Безанилла Ф. (1993) Микросекундный отклик мероцианинового красителя, чувствительного к напряжению: быстрые измерения с помощью зажима напряжения на аксоне гигантского кальмара. Japn J Physiol 43: Suppl. 1: S37-S41.
    7. 7.Чанда Б., Бланк Р., Фариа Л.К., Швейцер Ф.Е., Моди I и др. (2005) Гибридный подход к измерению электрической активности генетически определенных нейронов. Nat Neurosci 8: 1619–1626. DOI: https: //doi.org/10.1038/nn1558. PubMed: 16205716.
    8. 8. Sjulson L, Miesenböck G (2008) Рациональная оптимизация и визуализация in vivo генетически закодированного репортера оптического напряжения. J Neurosci 28: 5582–5593. DOI: https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0055-08.2008. PubMed: 18495892.
    9. 9.Siegel MS, Isacoff EY (1997) Генетически закодированный оптический зонд мембранного напряжения. Нейрон 19: 735–741. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0896-6273 (00) 80955-1. PubMed: 9354320.
    10. 10. Sakai R, Repunte-Canonigo V, Raj CD, Knöpfel T (2001) Дизайн и характеристика кодируемого ДНК, чувствительного к напряжению флуоресцентного белка. Eur J Neurosci 13: 2314–2318. DOI: https: //doi.org/10.1046/j.0953-816x.2001.01617.x. PubMed: 11454036
    11. 11. Lundby A, Mutoh H, Dimitrov D, Akemann W, Knöpfel T (2008) Разработка генетически кодируемого флуоресцентного датчика напряжения, использующего быстрые движения Ci-VSP, чувствительные к напряжению.PLOS ONE 3: e2514. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.pone.0002514. PubMed: 18575613.
    12. 12. Lundby A, Akemann W, Knöpfel T (2010) Биофизическая характеристика флуоресцентного белкового зонда напряжения VSFP2.3 на основе чувствительного к напряжению домена Ci-VSP. Eur Biophys J 39: 1625–1635. DOI: https://doi.org/10.1007/s00249-010-0620-0. PubMed: 20686764.
    13. 13. Муто Х., Перрон А., Димитров Д., Ивамото Ю., Акеманн В. и др. (2009) Спектрально-разрешенные характеристики отклика трех наиболее продвинутых датчиков напряжения флуоресцентных белков на основе FRET.PLOS ONE 4: e4555. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.pone.0004555. PubMed: 19234605.
    14. 14. Tsutsui H, Karasawa S, Okamura Y, Miyawaki A (2008) Улучшение измерений мембранного напряжения с помощью FRET с новыми флуоресцентными белками. Нат методы 5: 683–685. DOI: https: //doi.org/10.1038/nmeth.1235. PubMed: 18622396.
    15. 15. Лам AJ, St-Pierre F, Gong Y, Marshall JD, Cranfill PJ et al. (2012) Улучшение динамического диапазона FRET с помощью ярко-зеленых и красных флуоресцентных белков.Нат Методы 9: 1005–1012. DOI: https: //doi.org/10.1038/nmeth.2171. PubMed: 22961245.
    16. 16. Джин Л., Хан З., Платиса Дж., Вултортон Дж. Р., Коэн Л. Б. и др. (2012) Потенциалы однократного действия и подпороговые электрические события, отображаемые в нейронах с помощью флуоресцентного белкового датчика напряжения. Нейрон 75: 779–785. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.neuron.2012.06.040. PubMed: 22958819.
    17. 17. Барнетт Л., Платиса Дж., Попович М., Пиерибоне В.А., Хьюз Т. (2012) Флуоресцентный генетически закодированный пробник напряжения, способный определять потенциалы действия.PLOS ONE 7: e43454. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.pone.0043454. PubMed: 22970127.
    18. 18. Perron A, Mutoh H, Launey T, Knöpfel T (2009) Флуоресцентные белки, чувствительные к красному смещению. Chem. Биол. 16: 1268–1277.
    19. 19. Мишина Ю., Муто Х., Кнёпфель Т. (2012) Перенос функций датчика напряжения Kv3.1 в изолированную область измерения напряжения Ci-VSP. Biophys J 103: 669–676. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.bpj.2012.07.031. PubMed: 22947928.
    20. 20.Akemann W, Mutoh H, Perron A, Park YK, Iwamoto Y, Knöpfel T (2012) Отображение динамики нейронной цепи с помощью чувствительного к напряжению флуоресцентного белка. J Neurophysiol 108: 2323-2337. DOI: https: //doi.org/10.1152/jn.00452.2012. PubMed: 22815406.
    21. 21. Lanyi JK (2004) Бактериородопсин. Анну Рев Физиол 66: 665-688. DOI: https: //doi.org/10.1146/annurev.physiol.66.032102.150049. PubMed: 14977418.
    22. 22. Lanyi JK (1992) Перенос протонов и взаимодействие энергии в фотоцикле бактериородопсина.J Bioenerget Biomembr 24: 169-179. DOI: https: //doi.org/10.1007/BF00762675. PubMed: 1326515.
    23. 23. Chow BY, Han X, Dobry AS, Qian X, Chuong AS и др. (2010) Высокоэффективное генетически нацеленное оптическое нейронное молчание с помощью световых протонных насосов. Природа 463: 98–102. DOI: https: //doi.org/10.1038/nature08652. PubMed: 20054397.
    24. 24. Kralj JM, Hochbaum DR, Douglass AD, Cohen AE (2011) Электрический всплеск в Escherichia coli, исследованный с помощью флуоресцентного белка, указывающего напряжение.Наука 333: 345–348. DOI: https: //doi.org/10.1126/science.1204763. PubMed: 21764748.
    25. 25. Kralj JM, Douglass AD, Hochbaum DR, Maclaurin D, Cohen AE (2012) Оптическая запись потенциалов действия в нейронах млекопитающих с использованием микробного родопсина. Nat Методы 9: 90–95. DOI: https: //doi.org/10.1038/nchembio.1135.
    26. 26. Уилт Б.А., Фицджеральд Дж. Э., Шнитцер М. Дж. (2013) Пределы дробового шума фотона при оптическом обнаружении нейрональных спайков и оценке времени спайков.Biophys J 104: 51-62. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.07.058. PubMed: 23332058.
    27. 27. Gradinaru V, Thompson KR, Deisseroth K (2008) eNpHR: галлородопсин Natronomonas, усиленный для оптогенетических применений. Brain Cell Biol. 36: 129–139. DOI: https: //doi.org/10.1007/s11068-008-9027-6. PubMed: 18677566.
    28. 28. Градинару В., Чжан Ф., Рамакришнан С., Мэттис Дж., Пракаш Р. и др. (2010) Молекулярные и клеточные подходы к диверсификации и расширению оптогенетики.Ячейка 141: 154–165. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.cell.2010.02.037. PubMed: 20303157.
    29. 29. Hofherr A, Fakler B, Klöcker N (2005) Селективный экспорт Kir2.1 по Гольджи контролирует стехиометрию функциональных гетеромеров канала Kir2.x. J Cell Sci 118: 1935-1943. DOI: https://doi.org/10.1242/jcs.02322. PubMed: 15827083.
    30. 30. Мэттис Дж., Тай К.М., Ференци Э.А., Рамакришнан С., О’Ши Д.Д. и др. (2011) Принципы применения оптогенетических инструментов, полученные на основе прямого сравнительного анализа микробных опсинов.Нат Методы 9: 159-172. DOI: https: //doi.org/10.1038/nmeth.1808. PubMed: 22179551.
    31. 31. Колоднер П., Лукашев Е.П., Чинг Ю.С., Руссо Д.Л. (1996) Депротонирование основания Шиффа, индуцированное электрическим полем, в мутантном бактериородопсине D85N. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 11618–11621. DOI: https: //doi.org/10.1073/pnas.93.21.11618. PubMed: 8876185.
    32. 32. Мольтке С., Кребс М.П., ​​Моллаагабаба Р., Хорана Х.Г., Хейн М.П. (1995) Внутримолекулярный перенос заряда в мутантах бактериородопсина Asp85-Asn и Asp212-Asn: влияние pH и анионов.Biophys J 69: 2074-2083. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0006-3495 (95) 80078-0. PubMed: 8580351.
    33. 33. Marinetti T, Subramaniam S, Mogi T, Marti T, Khorana HG (1989) Замена аспарагиновых остатков 85, 96, 115 или 212 влияет на квантовый выход и кинетику высвобождения и захвата протонов бактериородопсином. Proc. Надль. Акад. Sci. США 86: 529-53.
    34. 34. Kalaidzidis IV, Kaulen AD (1997) Cl-зависимые реакции бактериородопсина на фотоэдс: сравнение мутантов D85T и D85S и кислой пурпурной формы дикого типа.FEBS Lett 418: 239-242. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0014-5793 (97) 01390-2. PubMed: 9428720.
    35. 35. Саиди П., Мусаабади Дж. М., Себтахмади С. С., Бехманеш М., Мехрабади Дж. Ф. (2012) Сайт-направленный мутагенез мутантов бактериородопсина и их характеристика для биоэлектрического и биотехнологического оборудования. Biotechnol Lett 34: 455–462. DOI: https: //doi.org/10.1007/s10529-011-0731-4. PubMed: 22270563.
    36. 36. Райан, доктор медицины, Дрю Дж. (1994) Опосредованное олигопептидом 2A вируса ящура 2A расщепление искусственного полипротеина.EMBO J 13: 928–933. PubMed: 8112307.
    37. 37. Шимчак А.Л., Уоркман С.Дж., Ван Й., Виньяли К.М., Дилиоглу С. и др. (2004) Коррекция мультигенного дефицита in vivo с использованием одного ретровирусного вектора на основе «саморасщепляющегося» пептида 2А. Nat Biotechnol 22: 589-594. DOI: https: //doi.org/10.1038/nbt957. PubMed: 15064769.
    38. 38. Boyden ES, Zhang F, Bamberg E, Nagel G, Deisseroth K (2005) Миллисекундная шкала времени, генетически направленный оптический контроль нейронной активности.Nat Neurosci 8: 1263–1268. DOI: https: //doi.org/10.1038/nn1525. PubMed: 16116447.
    39. 39. Акербум Дж., Чен Т.В., Уордилл Т.Дж., Тиан Л., Марвин Дж. С. и др. (2012) Оптимизация индикатора кальция GCaMP для визуализации нервной активности. J. Neurosci 32: 13819-13840. DOI: https: //doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2601-12.2012. PubMed: 23035093.
    40. 40. Akemann W, Mutoh H, Perron A, Rossier J, Knöpfel T (2010) Визуализация электрических сигналов мозга с помощью генетически нацеленных чувствительных к напряжению флуоресцентных белков.Nat Методы 7: 643–649. DOI: https: //doi.org/10.1038/nmeth.1479. PubMed: 20622860.
    41. 41. Shamah SM, Lin MZ, Goldberg JL, Estrach S, Sahin M et al. (2001) Рецепторы EphA регулируют динамику конуса роста с помощью нового фактора обмена гуаниновых нуклеотидов – эфексина. Ячейка 105: 233-244. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0092-8674 (01) 00314-2. PubMed: 11336673.
    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *