С.elegans онлайн-хранилища

Геномные последовательности

Когда в 1998 г. была опубликована последовательность генома C. elegans размером 100 Мб (Консорциум по секвенированию генома C. elegans , 1998 г.), считалось, что пропущено очень мало важной информации.Тем не менее, осталось несколько неподатливых пробелов, и мы целью с самого начала для полного описания содержания и структуры этого эталонного генома. С упорством мы теперь с помощью различных методов накопили информацию о картировании и последовательности, которая завершает геном. Работа позади это достижение кратко изложено в текстовом поле 1 и описано более подробно в дополнительных материалах.

В результате C.elegans последовательность полностью примыкает теломер к теломере и с митохондриальным геномом составляет 100 291 840 п.н. Несколько проблем могут остаться, такие как необнаруженные делеции в клонах или незначительные неправильные сборки. Несколько длинных многокопийных тандемных повторов, где не полностью секвенированные, охарактеризованы в отношении содержания последовательности и помечены как таковые в записях о последовательностях. Но из-за того, что используются иерархические (клонированные) методы дробовика, все более крупные геномные дупликации должны быть разрешены (включая один тандемный повтор размером 108 т.п.н. с 10 различиями в последовательностях между двумя копиями).Была оценена базовая частота ошибок при <10 ^-5 . Сообщения от сообщества о проблемах с последовательностью в настоящее время чрезвычайно редки, что позволяет предположить, что оставшиеся проблемы редки, правда. Геном кажется в хорошей форме!

Сравнение родственных геномов представляет собой мощный инструмент для интерпретации генома. В поддержку этой цели был разработан проект была получена последовательность генома Caenorhabditis briggsae (Stein et al. 2003). В ходе этого полногеномного дробовика была получена последовательность, состоящая всего из 899 суперконтигов (упорядоченных и ориентированных непрерывных последовательностей). сегментов), охватывающих 106 Мб последовательности ДНК с ~ 3 Мб невыявленных перекрытий и еще ~ 2 Мб предполагаемых пробелов. В сочетании с физической картой 102 Мб были помещены в 142 ультраконтига («суперконтиги», упорядоченные и ориентированные по их положению внутри физическую карту).Совсем недавно построение генетической карты с использованием однонуклеотидных полиморфных (SNP) маркеров стало возможным. расположили 100 Мб вдоль шести хромосом и уточнили карту последовательности (R.H. Waterston, S. Baird, L. Hillier, and R. Miller, неопублик.).

Последовательность C. briggsae оказалась полезной для прогнозирования генов (Wei et al. 2005), определения регуляторных элементов (Luersen et al. 2004; Teng et al.2004) и распознавание микроРНК (миРНК; см. ниже). Но при сравнении только двух видов сигналы отбора часто трудно выделить из шума нейтральных перемен. Чтобы повысить эффективность анализа, в настоящее время исследуются дополнительные геномы нематод. (http://www.genome.gov/11007952), включая три наиболее близких из известных геномов Caenorhabditis , Caenorhabditis remanei, Caenorhabditis japonica и Caenorhabditis n.сп. PB2801 и более отдаленные виды Pristionchus pacificus и Brugia malayi (http://www.genome.gov/10002154). Все они основаны на полногеномных сборках дробовиков. Три дополнительные последовательности Caenorhabditis должны уточнить определение консервативных признаков и могут выявить последовательности, которые изменились быстрее за один раз. родословная, но не в других. Последовательность нескольких видов может быть особенно важной при определении регуляторных элементов и гены некодирующей РНК.Множественные виды Caenorhabditis в сочетании с более отдаленными родственными нематодами также должны дать представление о структурно-функциональных взаимосвязях. на уровне белка. Поскольку затраты на секвенирование продолжают снижаться, несомненно, будет проведено полное секвенирование других изолятов C. elegans , что расширит наши знания о функциональных элементах и ​​их эволюции.

Генная аннотация

Гены, кодирующие белки

Идентификация полного комплекта C.elegans генов, кодирующих белки, приближается к завершению. WormBase (выпуск WS140) (Chen et al. 2005a) в настоящее время перечисляет 19 735 генов с 2685 альтернативными формами сплайсинга, в результате чего прогнозируемое количество белков достигает 22 420 (продуцирующих 22 269 уникальных пептидных последовательностей). Более 90% генов альтернативного сплайсинга имеют только один или два альтернативных сплайсинга. формы (Спит и Лоусон, 2005). Trans – сплайсинг распространен в червях, причем более половины C.elegans премРНК, получающих лидерную последовательность SL1 и 20% SL2 (Blumenthal 2005). Более 90% генов напрямую подтверждены экспериментальными данными.

Текстовое поле 1. Завершение последовательности генома C. elegans

На момент публикации в 1998 г. насчитывалось несколько десятков незаконченных YAC и три незаконченных космиды и фосмиды.Все эти клоны завершена в течение следующих года или двух с использованием набора методов, доступных для завершения клонирования (International Human Genome Sequencing Consorsome end. 2004). Кроме того, мы исправили около 20 неправильно собранных, неоднозначных или удаленных областей, а также около 200 одноосновных исправлений (в основном в ранних проектах) в результате подробного анализа тегов экспрессированных последовательностей (EST) (McCombie et al. , 1992; Waterston et al., 1992; Kohara, 1996; The C.elegans Консорциум секвенирования генома, 1998 г.) и другие данные, включая отзывы сообщества.

Что еще более важно, на хромосомах III и IV остались два внутренних пробела в карте, соответственно, где не было связующих клонов. были доступны и три теломерные (правая Хромосома II, где левая и правая – с привязкой к генетической карте) или субтеломерные (Хромосома I осталась и Хромосома X осталась) пробелы.Теломерный клон cTel33B (один из одиннадцати, выделенных Wicky et al., 1996) в конечном итоге перекрыл Y74C9, поскольку его последовательность была завершена, закрывая левый конец хромосомы I. Плазмида cTel7X была связана к Y35H6 на левом конце хромосомы X через три фрагмента ПЦР, закрывающие этот конец хромосомы.

Внутренние разрывы сохранялись, несмотря на высокую избыточность первоначально картированных клонов (примерно в 30 раз выше YAC, космид и fosmid клоны) и после проверки новой библиотеки BAC (Exelixis, http://www. exelixis.com, перс. комм.). Учитывая редкость этих областей в больших библиотеках вставочных клонов, мы обратились к стратегии прямого субклонирования. и прямое секвенирование рестрикционного фрагмента из цельной геномной ДНК для этих внутренних пробелов и неклонированной теломеры из Хромосома II справа.

Области, содержащие внутренние промежутки и оставшуюся теломеру, картировали с помощью макрорестрикционного Саузерн-блота, с использованием зондов, полученных из известной фланкирующей последовательности.Чтобы получить полезную чистоту фрагментов, мы приняли последовательный дайджест схема с использованием гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) для выделения продукта первого переваривания, переваривания его на месте с помощью второй фермент и субклонирование выделенной ДНК из второй очистки PFGE. Неизбежно эти библиотеки были заражены с соочищающей ДНК (50%-95% контаминации), но в каждом случае легко идентифицируется доминирующий контиг, а остальные учитываются для с известной последовательностью.

Охватывающая последовательность для внутренних промежутков в каждом случае составляла небольшую часть размера, предсказанного саузерн-блоттингом (6 т.п.н. против предсказанных 250 т.п.н. и 20 т.п.н. против 70 т.п.н. для хромосом III и IV соответственно). Возможно подвижность осколков в PFGE могут быть аномальными при высоких концентрациях (Доггетт и др., 1992) (мы использовали 50-100 мк/мл) или являться результатом необычных особенностей последовательности, которые также могут объяснить плохое представление регионов в библиотеках.Сегмент теломер лучше согласовывался (82 т.п.н. против предсказанных 90 т. п.н.), с учетом разницы. по крайней мере частично, путем исключения повтора теломер из собранной последовательности.

Нематоды необычны среди животных наличием оперонов, кластеров полицистронных генов, содержащих два или более генов (Blumenthal and Gleason 2003; Blumenthal 2005). В настоящее время идентифицировано более 1000 оперонов, каждый из которых содержит от двух до восьми генов, что составляет примерно 15% все С.elegans ген. Те гены, которые кодируют основной аппарат экспрессии генов, чаще включаются в опероны, тогда как тканеспецифические гены, как правило, не являются частью оперонов (Blumenthal and Gleason 2003).

Набор генов, кодирующих белок, первоначально был основан на предсказаниях GeneFinder (P. Green, неопубликовано), программы предсказания генов. разработан совместно с проектом генома C. elegans (The C.elegans Консорциум секвенирования генома, 1998 г.). Точность предсказания отдельных экзонов была высокой, но предсказание полных генов было менее надежным из-за комбинаторика мультиэкзонных генов и проблемы обнаружения начала и окончания генов, особенно в организме с оперонами. Тем не менее, предсказания GeneFinder послужили отличной отправной точкой и послужили сообществу червей. Что ж.

Компьютерные предсказания были подтверждены и изменены экспериментальными данными.Теги экспрессированной последовательности (EST), выровненные с геном теперь насчитывает более четверти миллиона (McCombie et al., 1992; Waterston et al., 1992; Kohara, 1996). Большинство EST исходят из лаборатории Kohara, которая использовала методы для уменьшения распространенности избыточных сообщений. В большинстве случаев ЭСТ были получены как из 5′-, так и из 3′-концов клонов кДНК, причем 3′-конец устанавливал 3′-UTR и сайт полиаденилирования и 5′-концевая выборка кодирующей области или установление 5′-UTR для полноразмерных клонов.В свою очередь, эти клоны предоставили представителей для полноразмерного секвенирования кДНК, в настоящее время в базе данных содержится более 2800 полноразмерных последовательностей. SAGE (серийный Анализ экспрессии генов) (Velculescu et al. 1995) из более чем 30 библиотек (http://elegans.bcgsc.ca/home/ge_consortium.html) червей различных стадий, условий роста, тканей и типов клеток дал более 2,5 миллионов высококачественных тегов (Маккей и др., 2003). Эти теги обеспечивают дополнительную поддержку 16 212 генов, из которых 2682 имеют только поддержку SAGE.Кроме того, теги SAGE раскрывают ~500 открытых рамок считывания (ORF) с гомологиями C. briggsae , которых нет в настоящих предсказаниях генов (G. Vatcher and D. Moerman, личное сообщение). Совсем недавно был метод разработан для получения 5′-концевых SAGE-подобных меток для сообщений с транспласированными лидерами SL1 или SL2 (Hwang et al. 2004). Первоначальный набор из 13 525 меток идентифицировал 5′-конец 2012 генов, подтверждая 5′-конец 1512 известных или предсказанных генов. и модифицируя конец еще 401 гена.Также были обнаружены 5′-концы 99 ранее неизвестных генов. Более крупная выборка 5′-концевых меток, которые в настоящее время находятся в стадии разработки, идентифицирует около 6500 5′-концов, 330 из которых не связаны с известными или предсказанными генами (B.J. Hwang, Х. Мюллер, С. Маккей, П. Хуанг, С. Гариб, С. Джонс, М. Марра, Д. Мурман, Д. Бейли и П.В. Штернберг, перс. комм.).

Поскольку эти основанные на случайной выборке методы становятся менее эффективными для подтверждения/обнаружения генов, направленные методы, которые начинаются с предсказанные модели генов стали более полезными. В рамках усилий по получению полноразмерных клонов кДНК для всех генов C. elegans (проект ORFeome) (Lamesch et al. 2004) было клонировано >12 500 ORF в векторах Gateway с использованием ОТ-ПЦР, начиная с модели генов. Помимо подтверждения транскрипции данных этих моделей также модифицируют предсказанные модели генов. Вместе с библиотеками EST, OST (теги последовательности ORFeome) (Lamesch et al. 2004) определяют границы 46 830 экзонов/интронов.Грин и его коллеги также использовали ОТ-ПЦР для систематического тестирования всех неподтвержденных интрон-экзонные границы (см. ниже) (P. Green, личное сообщение).

Многие из оставшихся неподдерживаемых моделей генов и любые еще не обнаруженные гены в геноме, вероятно, плохо экспрессируются, могут иметь более слабые статистические сигналы и могут хуже сохраняться у разных видов, что затрудняет их идентификацию либо вычислительные или экспериментальные средства более сложные. Улучшения в программах прогнозирования генов могут помочь выявить эти сигналы. Twinscan (Korf et al. 2001), основанная на HMM программа, производная от GenScan (Burge and Karlin 1997), которая может использовать сравнительную последовательность в прогнозах, использовала более реалистичную модель длины интрона, добавила минорный сплайсинг вариант таблицы сплайсинга и последовательность C. briggsae для получения улучшенного набора генов по сравнению с текущими предсказаниями WormBase (Wei et al. 2005). Хотя большинство прогнозов Twinscan хотя бы частично совпадают с существующими прогнозами, >2000 являются уникальными для Twinscan.ОТ-ПЦР эксперименты предполагают, что более половины из них могут быть расшифрованы (Wei et al. 2005). В широкой атаке на оставшиеся неподтвержденные экзоны и гены П. Грин (неопубликовано) использовал существенно улучшенный GeneFinder. с ослабленными ограничениями, чтобы захватить большинство реальных генов за счет ложных срабатываний. Все неподтвержденные экзон-интрон границы проверяются с помощью ОТ-ПЦР по всему геному. Кроме того, праймеры SL1 и SL2 используются в сочетании с внутренние праймеры для идентификации 5′-концов трансформированных сообщений.Предварительный анализ данных свидетельствует о том, что ген set может возрасти до >21 000 подтвержденных генов, кодирующих белок. Стремление завершить набор генов, несомненно, станет вызовом наши представления о генах.

Гены некодирующей РНК

Многие транскрипты функционируют на уровне РНК, включая рРНК, тРНК, мяРНК и мякРНК. C. elegans содержит все основные типы генов эукариотической РНК: >1300 (Stricklin et al.2005) этих генов, включая 630 тРНК, 78 мяРНК и 17 мяРНК. Из генов рРНК 18S, 28S и 5.8S транскрибируются отдельно РНК-полимеразой I в ~55 копиях повтора рДНК размером 7,2 т. п.н. на I (Sulston and Brenner 1974; The C. elegans Sequencing Consortium 1998). Ген 5S вместе со сплайсированным лидерным геном SL1 лежит в тандемном повторе размером 1 т.п.н. с примерно 110 копиями на V (Sulston and Brenner 1974; Nelson and Honda 1985). (Из-за неуверенности в точном количестве копий этих больших тандемных повторов включены только репрезентативные члены каждого из них. в последовательности.) Также в геноме рассеяно 20 копий повтора SL2. В дополнение к этим хорошо известным генам, Гены lin-4 и let-7 предоставили первые примеры функциональных микроРНК (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993; Reinhart et al., 2000), которые в настоящее время признаны общими чертами эукариотических геномы, в том числе человека. Действительно, многие гены микроРНК червей имеют четких гомологов в геномах млекопитающих. В настоящее время разрабатываются методы крупномасштабной проверки предсказанных микроРНК in vivo. цели в C.элегантный ; например, дюжина новых предсказанных мишеней let-7 была протестирована с использованием сравнительного анализа экспрессии в трансгенных червях (N. Rajewsky, S. Lall и F. Piano, неопубликованные). Вычислительными и экспериментальными методами было идентифицировано не менее 114 генов микроРНК (Ambros et al., 2003; Griffiths-Jones, 2004; http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/). эти РНК в клетке и процессах развития.

Другие новые гены РНК и семейства генов вполне могут существовать в геноме червей. Современные вычислительные методы для выявления таких гены и семейства используют сохранение вторичной структуры у разных видов, но подвержены высокому уровню ложноположительных результатов (Rivas and Eddy 2001; Lim et al. 2003), что скрывает настоящие гены. С секвенированием дополнительных родственных видов (Rivas and Eddy 2001; Coventry et al. 2004; Washietl et al.2005) частота ложноположительных результатов может снизиться в достаточной степени, чтобы позволить появление дополнительных генов РНК. SAGE может предоставить доказательства для некоторых генов РНК (Jones et al. 2001), а разработка мозаичных микрочипов, покрывающих практически весь геном, вполне может указывать на дополнительные возможные генов для более детального изучения.

Глобальные исследования, обеспечиваемые последовательностями генома

Последовательность генома, предоставляя всестороннее представление информации, необходимой для описания животного и его поведения, стимулировал множество систематических исследований для определения функциональных элементов генома и получения функциональной информации. об этих элементах более эффективно. Иногда эти наборы данных дают прямое представление о биологическом механизме; более часто они предоставляют ресурсы, которые позволяют следователям, сосредоточенным на конкретных механизмах, ускорить свою работу. Все чаще эти более систематические подходы интегрируются в более конкретные исследования. Мы предоставляем примеры этих наборов данных и их использование ниже.

Экспрессия генов

В многоклеточном организме основное понимание функции гена происходит из того, когда, где и при каких условиях ген выражено.Были реализованы подходы, которые позволяют получать данные об экспрессии многих генов параллельно, и другие систематические усилия. по последовательности генома. Многие из этих подходов используются совместно с другими организмами; другие используют всесторонние знания простой анатомии червя и линии клеток для обеспечения высокого временного и анатомического разрешения.

Большие наборы данных, измеряющие уровни РНК в определенных популяциях червей, доступны как для анализа микрочипов, так и для SAGE.Микрочипы предоставляют данные сразу по многим генам, но зависят от текущего состояния моделей генов, в то время как SAGE и родственные подходы дают потенциально беспристрастная выборка, но они дороже. Данные микрочипов были получены в результате сотен экспериментов с использованием популяции червей, включая различные стадии, разного пола и мутанты, а также различные условия роста. В начале много часть данных была получена с использованием массивов пятнистой ДНК, и они продолжают широко использоваться (http://www.genome.wustl.edu/genome/celegans/microarray/ma_gen_info.cgi). Эти ресурсы были дополнены массивами от коммерческих поставщиков. Например, Affymetrix предлагает чип, представляющий примерно 22 500 транскриптов из почти 19 000 моделей генов (http://www. affymetrix.com/products/arrays/specific/celegans.affx), а NimbleGen предлагает чип с 390 000 зондов, охватывающих 21 121 ген с минимум 17 зондами на ген. (http://www.nimblegen.com/products). Кластеризация результирующих данных об экспрессии выявляет наборы генов, которые одинаково реагируют в исследованных популяциях. и на основании присутствия ранее охарактеризованных генов в этих кластерах можно сделать выводы о роли генов в группе.Например, в новаторском исследовании Ким и его коллеги (Ким и др., 2001) обнаружили 44 различных кластера и смогли связать 30 из них с возможными функциями. Ранний анализ SAGE нацелен различия в паттернах экспрессии генов между дауэровскими и недауэровскими червями, что подчеркивает существенные различия в транскрипции на специализированной стадии дауэра и идентификации некодирующих транскриптов с последовательностью, связанной с теломерным повтором (Jones et al. 2001).В другом приложении SAGE использовался для сравнения долгоживущих мутантов с контрольными популяциями, чтобы выявить гены и пути. потенциально участвует в увеличении продолжительности жизни (Holt and Riddle 2003). Эти эксперименты также продемонстрировали потенциал SAGE для выявления ранее неизвестных генов и альтернативного сплайсинга и варианты полиаденилирования.

С помощью амплификации, с учетом связанных с этим оговорок, экспрессия генов была измерена в небольших популяциях очищенных типов клеток и в тщательно поставленных эмбрионах.Определенные типы клеток могут быть помечены с помощью тканеспецифических промоторов, управляющих GFP. (зеленый флуоресцентный белок), и примерно до 400-минутной стадии эмбриональные клетки могут диссоциировать с мечеными клетками. восстановлены с помощью FACS (сортировка клеток с активированной флуоресценцией). Клетки могут быть собраны немедленно или помещены в культуру, чтобы позволить дальнейшая дифференциация (Christensen et al. 2002; Zhang et al. 2004; Blacque et al. 2005; Fox et al. 2005) и анализ на содержание мРНК либо с помощью микрочипового анализа, либо с помощью SAGE.В варианте этого меченый поли(А) связывающий белок (PABP) экспрессируется в специфических типах клеток, и мРНК из этих клеток выделяют с помощью иммунопреципитации (Roy et al. 2002; Kunitomo et al. 2005). Чтобы получить информацию о временной прогрессии экспрессии генов в раннем эмбриогенезе, Боуг и его коллеги (Baugh и другие. 2003, 2005) стадировали небольшие когорты эмбрионов путем визуального отбора эмбрионов на стадии четырех клеток, которым затем давали возможность развиваться.Образцы брали с интервалами, приблизительно равными последовательным циклам клеточного деления эмбриона. Количественный анализ полученных данных показали последовательные наборы экспрессии генов, предполагая причинно-следственную связь. Эта связь была подтверждена в качестве нескольких примеров, раскрывающих несколько потенциальных регулирующих сетей.

В отличие от методов выделения РНК, генные продукты (мРНК или белок) можно анализировать непосредственно у животных для определения место и время экспрессии гена.Для этой цели традиционно использовались как гибридизация РНК, так и антитела. РНК методы in situ легче применять систематически, и Кохара (http://www.nig.ac.jp/section/kohara/kohara-e.html; nematode.lab.nig.ac.jp/db2/index.php 😉 в настоящее время отображает полные изображения in situ 11 237 клонов кДНК с различными стадиями, доступными для проверки. Определенный тканевые паттерны легко распознаются, но определить индивидуальную клеточную идентичность сложно.Методы антител были сложнее масштабировать, но новые методы создания высокоаффинных реагентов могут изменить это.

Появление методов маркировки GFP in vivo позволяет визуализировать паттерны экспрессии генов у живых червей. Промоутер::ГФП слияния создаются в масштабе генома в связи с проектом Promoterome (Dupuy et al. 2004) — в рамках этих усилий уже были выпущены слияния промоторов (до 2 т.п.н.) примерно с 6500 C.elegans гена, и в настоящее время разрабатываются планы по созданию более полного набора. Две группы систематически трансформируют эти конструкции. или родственные с использованием ПЦР и визуализации полученных червей с помощью флуоресцентной микроскопии. Веб-сайт Лаборатории Надежды (http://129.11.204.86:591/default.htm) содержит описания и изображения для более чем 300 генов, а также сайт Центра генома Британской Колумбии (http://www.bcgsc.ca/gc/celegans/ ) предоставляет информацию примерно о 1750 генах, с изображениями, доступными для подмножества из них.Первая группа сосредоточилась на транскрипции факторы, в то время как последний нацелился на гена C. elegans с человеческими гомологами. Верность паттернов трансгенов нативным генам, конечно же, является центральным вопросом при таком подходе. подходит. Трансгены, введенные путем инъекции, обычно включаются в большие внехромосомные массивы и подвергаются к соматической утрате и молчанию зародышевой линии; тем не менее, наблюдаемые паттерны экспрессии в целом были надежными.Кроме того, промоторы и другие регуляторные последовательности не определены для большинства генов C. elegans , так что в обоих проектах целесообразно использовать восходящую область произвольной длины для управления экспрессией. Поскольку межгенные области C. elegans обычно небольшие, часто эти конструкции распространяются на соседний ген. Несмотря на эти очевидные ограничения, доступный ген Образцы выражения очень ценны.

Проблемой использования данных экспрессии in vivo является необходимость в эксперте для интерпретации паттернов.Чтобы обойти это, наша лаборатория (З. Бао, Дж. Мюррей, Т. Бойл и Р. Уотерстон, неопубликовано) приступила к проекту, который позволит автоматизировать задание экспрессии генов в отдельных клетках на протяжении всего раннего развития. Метод использует четырехмерные изображения червей с ядра, помеченные слитыми GFP-гистонами, чтобы следить за клеточными делениями на протяжении всего эмбриогенеза, тем самым автоматизируя определение клеточного происхождения.Поскольку линия дикого типа очень воспроизводима и судьба каждой дочерней клетки известна, знание истории происхождения животного равносильно знанию его анатомии. Представление второго репортера ген, управляемый интересующей последовательностью промотора, в этот фон, таким образом, обещает предоставить данные об экспрессии с разрешение одной ячейки и высокая временная точность автоматически. Введение конструкций с помощью бомбардировки также может дать однокопийные интегранты и во многих случаях обходят сайленсинг зародышевой линии. Текущая реализация прослеживает родословную через 250 клеток с незначительным редактированием и, таким образом, уже используется для ранних эмбриональных событий.

Нарушение гена

Второе мощное понимание функции гена связано с анализом фенотипа животных, несущих мутантные формы гена. Традиционные методы, включая химический мутагенез, облучение и вставку транспозонов, продуцировали мутантные аллели в менее 1000 генов.Кроме того, гомологичная рекомбинация, столь мощная у дрожжей и млекопитающих, относительно неэффективна. в C. elegans .

К счастью, появились другие методы, позволяющие систематически нарушать функцию генов. С момента его обнаружения в червя (Fire et al., 1998; Piano et al., 2000; Sonnichsen et al., 2005), РНК-интерференция (РНКи), при которой двухцепочечная РНК индуцирует специфичную для последовательности деградацию гомологичных мРНК, стала наиболее широко используемые средства ингибирования функции генов. Двухцепочечная РНК может быть введена инъекцией, замачиванием и даже путем кормления червей бактериями, экспрессирующими dsRNA (Timmons and Fire 1998). Ингибирование редко бывает полным, а гены, экспрессируемые нейронами, особенно устойчивы к эффектам РНК-интерференции. Тем не менее, простота использования питающих библиотек и других способов доставки облегчила систематические полногеномные скрининги РНКи несколькими группы (Фрейзер и др., 2000; Маэда и др., 2001; Камат и Арингер, 2003; Сонничсен и др..2005), и в настоящее время создано и широко распространено более 18 000 штаммов Escherichia coli . Первоначальные скрининги были для легко оцениваемых фенотипов, таких как жизнеспособность, медленный рост или измененные движения и форма тела. Эти и другие скрининги позволили получить фенотипы более чем для 3300 генов. (библиотека РНКи E. coli охватывает 86% всех генов C. elegans ) (http://www.gurdon.cam.ac.uk/~ahringerlab/pages/rnai.html), включая 721 необходимый ген для эмбриогенеза (Vidalain et al.2004). Чтобы изучить генетическую устойчивость на функциональном уровне, проводится двойной скрининг РНК-интерференции для проверки 2000 предполагаемых дублирующиеся пары генов для избыточной функции (S. Woods and J. Ahringer, неопубликованные). Библиотека РНКи используется все чаще для скрининга более специфических фенотипов или определенных мутантных фонов, включая фоны, которые, по-видимому, усиливают РНКи эффекты (Ванг и др., 2005). Их успех, в свою очередь, стимулировал усилия по автоматизации различных аспектов анализа фенотипа.

Чтобы дополнить РНК-интерференцию и обеспечить постоянные линии с трансмиссивными дефектами, в настоящее время осуществляются проекты по удалению генов с использованием либо химически индуцированные делеции, либо транспозоны. Оба метода используют ПЦР для выявления различий в длине в популяциях обработанных животных. животные. В настоящее время Консорциум по нокауту генов (http://www.celeganskoconsortium.omrf.org/) и Национальный центр биоресурсов (http://shigen.lab.nig.ac.jp/c.elegans/index.jsp) имеют сгенерированные генные делеции. Первый вызвал делеции примерно в 1800 генах, причем более 1300 из них стабилизировались. и заархивирован, а в последнем перечислено около 1600 делеций генов. Консорциум NemaGENETAG (http://elegans.imbb.forth.gr/nemagenetag/home.html) произвел >150 штаммов, меченных Mos1, и планирует сделать еще больше (P. Kuwabara, неопубликовано). TILLING (нацеливание на индуцированное местное Поражения в геномах) подход (McCallum et al.2000), поскольку он адаптируется к любому организму, который может подвергаться химическому мутагенезу, был использован в C. elegans и доказал свою эффективность в создании точечных мутаций, включая стоп-кодоны (R. Plasterk, неопубликовано). TILLING имеет потенциал преимущество получения аллельного ряда (мутации разной степени тяжести). Поскольку затраты на секвенирование снижаются, прямое секвенирование мутагенизированных линии могут стать методом выбора (R. Plasterk, личное сообщение).

Генная регуляция

Сигналы, контролирующие активность генов во времени и пространстве, также встроены в геном.Они действуют на уровне ДНК как промоторы и прочие цис – регуляторные элементы; на уровне РНК как элементы, регулирующие трансляцию и стабильность; и на белковом уровне через посттрансляционная модификация и оборот. В отличие от областей, кодирующих белок, в настоящее время не существует алгоритмов, которые могли бы эффективно распознавать эти сигналы ab initio в последовательности генома. Ранние работы в этой области были сосредоточены на отдельных генах и через традиционные методы установили точные последовательности, управляющие экспрессией генов (Okkema and Fire 1994; Fukushige et al. 1996 год; Оккема и др. 1997). Но с последовательностью генома, комбинацией данных экспрессии генов, сравнительного анализа последовательностей и улучшения компьютера программы, есть прогресс в распознавании элементов ДНК и в некоторой степени элементов РНК.

На уровне ДНК наборы экспрессии генов, описанные выше, имеют решающее значение, позволяя группировать или стратифицировать гены по время и ткани.Были идентифицированы элементы-кандидаты, связанные с генами, экспрессируемыми в тепловом шоке (Nikolaidis and Nei 2004), мышцах (GuhaThakurta et al. 2004) и кишечнике (Gaudet et al. 2004), особенно в глотке. Напр., Mango и ее коллеги (Gaudet et al. 2004) идентифицировали гены, экспрессирующиеся в глотке, путем сравнения мутантных эмбрионов, обогащенных и обедненных клетками глотки, с использованием микрочипов. Они сгруппировали гены по ранней или поздней экспрессии, а затем, проанализировав виды и гены, идентифицировали девять возможные регуляторные мотивы, два из которых были известны ранее. Они подтвердили активность некоторых из них in vivo и, в свою очередь, использовали мотивы для поиска дополнительных генов с мотивами. Полученные наборы были значительно обогащены для гены экспрессируются в глотке. Эта стратегия должна стать более действенной по мере появления дополнительных последовательностей генома Caenorhabditis и уточнения данных об экспрессии генов.

Параллельно с данными экспрессии и сравнительным анализом генома исследователи пытались идентифицировать целевую последовательность для известных факторов транскрипции.Используя одногибридную систему дрожжей, мотивы, распознаваемые ДНК-связывающими доменами около 600 транскрипционных факторов червя систематически анализируются (Deplancke et al. 2004). Другие изучают способы применения преципитации хроматина для обнаружения in vivo участков взаимодействия белок-ДНК и использовать гиперчувствительность к ДНКазе I для поиска участков открытого хроматина. SELEX (систематическая эволюция лигандов путем экспоненциальной амплификации) предлагает другой подход к идентификации мотивов связывания, который можно применять в масштабе (Roulet et al.2002). Объединение знаний о сайтах связывания факторов транскрипции и идентификации функциональных сайтов, связанных с генами может дать мощное представление о сетях регуляции генов, лежащих в основе развития.

Многие мотивы, закодированные в ДНК внутри генов, действуют на уровне РНК, регулируя сплайсинг, локализацию, трансляцию, редактирование РНК, или другие процессы. Эти регуляторные элементы РНК можно изучать в основном так же, как и регуляторные элементы транскрипции. элементы: сохранение последовательности может использоваться для идентификации элементов-кандидатов; эксперименты с вытягиванием вниз могут связывать РНК-связывающие белки к их генам-мишеням и мотивам-кандидатам; функция может быть проанализирована путем слияния с репортерными белками. C. elegans имеет около 500 РНК-связывающих белков, и генетический, биохимический и компьютерный анализы выявили критическую роль белка-РНК. комплексы, 3′-нетранслируемые области, РНК-связывающие белки (и их мишени) и РНК-РНК-взаимодействия в процессе развития.

Сложность определения регуляторных элементов РНК заключается в том, что регуляторная информация часто находится внутри трехмерного вторичная структура РНК, а не кодируется непосредственно в первичной последовательности.Это затрудняет прогнозирование элементы в вычислительном отношении. Компьютерное предсказание регуляторных элементов РНК должно идти рука об руку со структурным анализом. анализ генов РНК, которые их регулируют.

Протеомика

Имея хорошо аннотированный геном C. elegans , можно продолжить как изучение отдельных белков, так и изучение взаимодействий между этими белками. В высокопроизводительная протеомная попытка подтвердить гены, кодирующие белок, G. Merrihew, J.H. Томас и М. Дж. МакКосс (неопубликованные) использование масс-спектрометрии для экспериментальной проверки даже небольших предсказанных ORF. В настоящее время они идентифицировали 3363 белка, 121 из которых ранее не имели экспериментальной поддержки (39 из них были идентифицированы на основе транслируемого набора межгенных ORF, и остаток от предсказаний GeneFinder) (P.Грин, неопубликовано). Другие добиваются успеха, используя масс-спектрометрию для определить относительные уровни белка у эмбрионов C. elegans и взрослых особей (Venable et al. 2004). Подходы масс-спектрометрии также должны выявлять посттрансляционные модификации, которые могут изменять активность.

Изучение индивидуальных белковых структур также идет полным ходом. Группа структурной геномики C. elegans сформировала высокопроизводительный конвейер «белок-структура» (Liu et al.2005b). Они определили кристаллическую структуру 78 белков или белковых фрагментов (http://sgce.cbse.uab.edu/index.php) и решили 19 структур (например, Symersky et al. 2003; Lu et al. 2004). Другая попытка структурной геномики (http://www.nesg.org; Wunderlich et al. 2004) идентифицировала семь структур.

Выявление белок-белковых взаимодействий и эффектов любых модификаций этих взаимодействий будет ключом к любому молекулярному анализу. понимание червя.Вычислительные методы, некоторые из которых используют сравнительные данные (Liu et al. 2005a; Sharan et al. 2005), могут выявить это, но крупномасштабные исследования зависят от экспериментальных данных. На вооружении набор 11000 клонированные ORF (проект C. elegans ORFeome) (Lamesch et al. 2004), исследователи создали карту интерактомной сети C. elegans , которая содержит >5500 потенциальных взаимодействий (Li et al. 2004) и движутся к определению весь набор.Наряду с другой картой для Drosophila melanogaster (Санчес и др., 1999), эти наборы данных, хотя и содержат большое количество ложноположительных и отрицательных результатов, тем не менее представляют собой первые в своем роде для многоклеточных организмов. Важно отметить, что карта интерактома служит основой для интеграции исследований развития и заболевания, как для отдельных белков, так и на уровне сетей взаимодействий.

Популяционная биология и эволюция

Помимо помощи в молекулярном понимании формы и поведения червя, последовательность генома также способствовала изучение эволюционных процессов, действующих на геном червей.Хотя мы не можем получить доступ к 90 003 предкам C. elegans 90 004, сравнительный анализ позволяет сделать выводы об этом наследственном состоянии и событиях, которые произошли после дивергенция двух видов.

Имея в распоряжении последовательность лабораторного штамма N2, изучение изменчивости различных изолятов C. elegans со всего мира стало простым. Вариацию можно легко определить либо с помощью ПЦР, областях или из случайных чтений последовательности всего генома из этих различных изолятов, выровненных с последовательностью N2.Лоскутный узор изменчивость большинства изолятов предполагает, что большинство изолятов возникло в результате межпородного скрещивания с последующей изоляцией, возможно, этому способствует гермафродитное размножение (Koch et al. 2000). Удивительно, но на местном уровне наблюдается высокое разнообразие населения — по шкале сантиметров, — но уровни разнообразия исчезают очень быстро, так что среди изолятов из разных стран примерно такое же разнообразие, как и среди изолятов из той же компостной кучи (Fitch 2005).

Однако оказалось, что среди различных изолятов гавайский штамм CB4856 имеет широко и более равномерно распределенную последовательность. различия (Wicks et al. 2001). Разница наблюдалась один раз на каждые 850 оснований, при этом переходов было больше, чем трансверсий (57% против 43%) и инделей (один добавлено или удалено больше оснований), что составляет более четверти различий. Как ни странно, этот показатель различия предполагают, что эффективный размер популяции не сильно отличается от человеческого.Недавнее сравнение геномов использование сравнительной гибридизации генома с микрочипами обнаруживает удивительное количество более крупных делеций в гавайском штамме. (Д. Моэрман, личное сообщение). Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) также послужили основой для эффективной генетической стратегия картирования (Wicks et al. 2001; Swan et al. 2002).

Аутосомы C. elegans имеют необычную организацию, при этом рекомбинация значительно повышена на терминальных третях по сравнению с центры.Эссенциальные гены чаще располагаются в центрах, в отличие от семейств генов, которые перепредставлены на руках. Это привело к предположению, что руки являются местами высокой смертности и рождения генов. В соответствии с этим понятием, Плотность SNP, по-видимому, повышена на руках (Koch et al. 2000). Сравнение геномов C. elegans и C. briggsae показало значительные различия в экспансии хемосенсорных генов на плечах у двух видов (Chen et al.2005b) и для положительного отбора членов семейства srz рецепторов, связанных с G-белком (Thomas et al. 2005), также сгруппированных на плечах. Кроме того, эволюция белков и регуляторов слабо связана у ортологов, но не у паралогов. и дубликаты обоих видов демонстрируют ускорение как регуляторной, так и белковой эволюции по сравнению с ортологами (Castillo-Davis et al. 2004). Поразительно, но геном C. briggsae демонстрирует тот же паттерн высокой рекомбинации на плечах аутосом, показывая, что это хорошо установленная особенность. архитектуры генома (Р.Х. Уотерстон, Л.В. Hillier, S. Baird и R. Miller, неопубликованные).

Сравнительные исследования пяти геномов Caenorhabditis могут также пролить свет на эволюцию гермафродитно-мужского способа размножения, который, как полагают, эволюционировал независимо в C. elegans и C. briggsae . Три других вида Caenorhabditis имеют женско-мужские половые системы. Простое сравнение геномов двух самооплодотворяющихся видов дало понимание динамики эволюции половых и гамет-специфических генов (Kiontke et al.2004 г.; Каттер и Уорд, 2005 г.; Наяк и др. 2005) и геномной организации репродуктивных генов (Miller et al. 2004). Интересно, что геномы как Caenorhabditis remanei , так и Caenorhabditis n. сп. PB2801 значительно больше, чем геномы самооплодотворяющихся видов (Дж. С. Джонстон, личное сообщение).

Червячная база

Центральным элементом предоставления всей этой информации сообществу была непрерывная разработка WormBase (Chen et al.2005а; http://www.wormbase.org), продукт ACeDB (база данных A C. elegans ; http://www.acedb.org). ACeDB была разработана совместно с проектом генома для координации усилий по интеграции последовательности с генетические и физические карты и обеспечить публичный доступ к проекту и его данным.

WormBase содержит широкий спектр информации о биологии и геномике червя. Он действует как хранилище всех аннотацию генома C.elegans , а также C. briggsae и родственные им нематоды. Он курирует модели генов, согласовывая прогнозы и различные наборы экспериментальных данных. Он приобретает связанная функциональная информация из экспериментов с высокой пропускной способностью и более традиционных экспериментов, описанных в литературе. WormBase также содержит обширную библиографию статей, опубликованных по C. elegans , а также неопубликованные рефераты с региональных совещаний и проводимых раз в два года Международных совещаний по червям, а также краткие отчеты. в вестнике червяков .

WormBase поддерживает пять различных методов доступа через свой интерактивный веб-интерфейс, каждый из которых адаптирован для конкретных целей. Эти

1. Просмотр веб-страниц для обычного пользователя с простыми запросами и навигацией по различным дисплеям;

2. пакетное извлечение

   для полей генов и последовательностей;

3. поиск на языке запросов

   , позволяющий выполнять специальные запросы для более искушенных пользователей;

4. массовых загрузки наборов генов, других наборов данных или даже всей базы данных для обеспечения локального доступа; и

5. сценариев, позволяющих форматировать и обрабатывать результаты запросов для тех, у кого есть некоторые навыки программирования.

WormBase также поддерживает распределенную систему аннотаций (DAS, также разработанную совместно с проектом генома червя). (Dowell et al. 2001), позволяя пользователям добавлять свои собственные дорожки данных на экран браузера.

WormBase продолжает развиваться, улучшая пользовательские интерфейсы и добавляя новые наборы данных, такие как фильмы, структуры белков и новые последовательности генома.

Выводы

Последовательность генома C. elegans , теперь завершенная, стимулировала исследования червя до такой степени, которую лишь смутно предвидели ранние сторонники Геномный проект. Воздействие выходит за рамки больших наборов данных, секвенирования дополнительных геномов нематод и Разработка червячной базы. Последовательность и связанные с ней ресурсы позволили отдельным лабораториям червей исследовать центральные биологические проблемы, а не процесс клонирования и секвенирования. Это также помещает их работу в более широкий контекст. Изобилие ресурсов также привлекла в эту область очень талантливых новых исследователей. Червь лидирует в исследованиях апоптоза, старение, развитие, нейробиология и другие области.

Но воздействие распространяется далеко за пределы самого червячного поля.Вдохновленные успехами C. elegans , EST были созданы почти для каждого основного класса нематод, паразитирующих в организме человека (Mitreva et al. 2005), и с геномом C. elegans в качестве точки отсчета эти наборы данных открывают новые возможности для победы над этими коварными болезнями. Нематод-специфический гены обеспечивают потенциальные мишени для лекарств, а C. elegans могут служить исходным испытательным стендом для оценки соединений-кандидатов.

В более широком смысле последовательность червя через GenBank и браузеры (UCSC ENSEMBL, NCBI) предоставляет червю портал для исследователи других организмов.Либо с помощью прямого поиска гомологии, либо с помощью установленных таблиц ортологии ученые могут быстро узнать, что C. elegans имеет ген, связанный с интересующим их геном, а затем из WormBase и литературы узнать, что известно об этом гене. Их вполне можно привлечь в поле для изучения гена червей из-за простоты экспериментов и богатства ресурсов. У многих исследователей червей в офисе появлялись коллеги, которые спрашивали, как проводить эксперименты с червями.Новые коллаборации В результате червячное поле чрезвычайно обогатилось этими «чужими» перспективами, открывающими возможности для воздействия на здоровье и благополучие человека, которые в противном случае могли бы быть упущены.

Влияние проекта генома C. elegans распространяется и на другие направления. Ранний успех проекта C. elegans EST был прямым предшественником широкомасштабных проектов общественного достояния EST человека и мыши, без которых млекопитающие микрочиповые и протеомные исследования в 1990-х годах были бы крайне ограничены.В секвенировании генома проект червя продемонстрировали возможность использования методов секвенирования на основе Сэнгера и иерархической (на основе клонов) стратегии дробовика для Проект генома человека. Примечательно, что проект червя также предоставил модель для политик выпуска данных Human. Геномный проект. Проект генома червя с самого начала принял политику быстрого и открытого выпуска данных, расширяя практика раннего обмена данными сообщества червей.Эта политика привлекла к проекту лаборатории червей, привела к четкому разграничению задач (центры генома предоставили последовательность, а отдельные лаборатории придали ей биологический смысл) и ускорили влияние последовательности.

Но задача понять червя на молекулярном уровне только началась. Захватив большую, но конечную информацию генома, теперь мы можем начать понимать грандиозность стоящей перед нами задачи.Нам нужен полный список деталей, а не только кодирование белка. гены, но и гены РНК, регуляторные элементы и любые другие функциональные элементы генома. Нам нужно знать мотивы что факторы транскрипции связываются in vivo, и это должно сочетаться с точным знанием того, когда, где и на каком уровне экспрессируется каждый ген. C. elegans , вероятно, единственное экспериментальное животное, у которого разрешение может быть на уровне одной клетки на протяжении всего развития; мы должны использовать это.С этой информацией должны появиться регулирующие сети, которые контролируют развитие, диаграммные модели развития. Успех с этой непритязательной нематодой снова окажет глубокое влияние на усилия по расширению этого знания биологии человека со всеми ее последствиями для здоровья и благополучия человека.

Но нам нужно выйти за рамки этого сетевого взгляда, чтобы достичь истинного молекулярного понимания биологии червей.Белковая функция будет должны быть определены подробно. Нокдауны РНКи, нокауты генов и сети белок-белковых взаимодействий станут началом, но наше знание функции должно идти намного глубже. Несомненно, нам нужно будет понять низкомолекулярную составляющую. клеток и их потока, а также.

Это будут сложные исследования, поскольку мы все глубже и глубже погружаемся в молекулярное описание.Потребуются общие ресурсы, новые методы и настойчивость. Но синергия науки, основанной на гипотезах и данных, за последнее десятилетие в сочетании с дух сообщества являются основными активами. Эти, с неотъемлемыми преимуществами червя, столь прозорливо признанными Бреннера более 40 лет назад, сделали C. elegans главным кандидатом для достижения такой грандиозной цели. Мы не можем упустить возможность.

Благодарности

Авторы выражают благодарность членам сообщества C.elegans Sequencing Consortium, а также члены команды WormBase. Авторы также благодарят Хайди Браунинг, Синди Мадей и Сьюзан. Strome за их советы и дары макрорестрикции Саузерн-блотс. Мы также благодарим Тима Шедла, Дона Мурмана, Линкольна Штейна, и Полу Штернбергу за комментарии к рукописи. Эта работа финансировалась Советом по медицинским исследованиям Великобритании, Wellcome Trust, Национальный исследовательский институт генома человека и Национальный институт общих медицинских наук в Национальные институты здоровья.

Сноски

• [Дополнительные материалы доступны на сайте www.genome.org.]

• Статья и публикация находятся по адресу http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.3729105.

• ↵5 Автор, ответственный за переписку. Электронная почта waterston{at}gs.washington.edu; факс (206) 685-7301.

• Лабораторный пресс в Колд-Спринг-Харбор

Каталожные номера

1. ↵

   Ambros, V. , Lee, R.C., Lavanway, A., Williams, P.T., and Jewell, D. 2003. МикроРНК и другие крошечные эндогенные РНК в C.Элеганс. Курс. биол. 13: 807-818.

2. ↵

   Боуг Л.Р., Хилл А.А., Слоним Д.К., Браун Э.Л. и Хантер С.П. 2003. Состав и динамика раннего эмбрионального транскриптома Caenorhabditis elegans . Развитие 130: 889-900.

3. ↵

   Боуг, Л.Р., Вен Дж.К., Хилл А.А., Слоним Д.К., Браун Э.Л. и Хантер С.П. 2005. Синтетический летальный анализ Caenorhabditis elegans генов формирования заднего эмбрионального паттерна идентифицирует консервативные генетические взаимодействия. Геном биол. 6: Р45.

4. ↵

   Блак О.Э., Перенс Э.А., Бороевич К.А., Инглис, П.Н., Ли, К., Уорнер, А., Хаттра, Дж., Холт, Р.А., Оу, Г., Мах, А.К., и другие. 2005. Функциональная геномика реснички, сенсорной органеллы. Курс. биол. 15: 935-941.

5. ↵
6. ↵

   Блюменталь, Т.и Глисон, К.С. 2003. Caenorhabditis elegans оперонов: форма и функция. Нац. Преподобный Жене. 4: 112-120.

7. ↵

   Бердж, К. и Карлин, С. 1997. Прогнозирование полных генных структур в геномной ДНК человека. Дж. Мол. биол. 268: 78-94.

8. ↵

   Кастильо-Дэвис, К.И., Хартл, Д.Л., и Ахаз, Г. 2004. цис – Регуляторная и белковая эволюция в ортологичных и дублирующих генах. Геном Res. 14: 1530-1536.

9. ↵

   Консорциум по секвенированию генома C. elegans . 1998. Последовательность генома нематоды C. elegans : Платформа для изучения биологии.Наука 282: 2012-2018.

10. ↵

    Чен Н. , Харрис Т.В., Антошечкин И., Бастиани К., Биери Т., Блазиар Д., Брэднам К., Канаран П., Чан Дж., Чен, С.К. и др. 2005а. WormBase: исчерпывающий ресурс данных по биологии и геномике Caenorhabditis .Нуклеиновые Кислоты Res. 33: Д383-Д389.

11. ↵

    Чен, Н., Пай, С., Чжао, З., Мах, А., Ньюбери, Р., Джонсен, Р.К., Алтун, З., Мурман, Д.Г., Бейли, Д.Л., и Штейн, Л.Д. 2005б. Идентификация семейства хемосенсорных генов нематод. проц. Натл. акад. науч. 102: 146-151.

12. ↵

    Кристенсен, М., Эстевес, А., Инь, X., Фокс, Р., Моррисон, Р. , Макдоннелл, М., Глисон, К., Миллер III, Д.М., и Стрейндж, К. 2002. Система первичной культуры для функционального анализа C. elegans нейронов и мышечных клеток. Нейрон 33: 503-514.

13. ↵

    Коулсон, А., Салстон, Дж., Бреннер, Ф.Р.С., и Карн, Дж. 1986. К физической карте генома нематоды Caenorhabditis elegans. проц. Натл. акад. науч. 83: 7821-7825.

14. ↵

    Коулсон, А., Waterston, R., Kiff, J., Sulston, J., and Kohara, Y. 1988. Связывание генома с искусственными хромосомами дрожжей. Природа 335: 184-186.

15. ↵

    Коулсон А. , Козоно Ю., Луттербах Б., Шонкин Р., Салстон Дж. и Уотерстон Р. 1991. YACs и геном C. elegans . Биоэссе 13: 413-417.

16. ↵

    Коулсон А., Хьюн К., Козоно Ю. и Шонкин Р. 1995. Физическая карта генома Caenorhabditis elegans . Методы клеточной биологии. 48: 533-550.

17. ↵

    Ковентри, А., Kleitman, D.J., and Berger, B. 2004. MSARI: Множественное выравнивание последовательностей для статистического обнаружения вторичной структуры РНК. проц. Натл. акад. науч. 101: 12102-12107.

18. ↵

    Каттер, А. Д. и Уорд, С. 2005. Половая и временная динамика молекулярной эволюции в развитии C. elegans .Мол. биол. Эвол. 22: 178-188.

19. ↵

    Депланке Б., Дюпюи Д., Видаль М. и Валхаут А.Дж. 2004. Дрожжевая одногибридная система, совместимая со шлюзом. Геном Res. 14: 2093-2101.

20. ↵

    Доггетт, Н.А., Смит, К.Л., и Кантор, К.Р. 1992. Влияние концентрации ДНК на подвижность при гель-электрофорезе в пульсирующем поле. Нуклеиновые Кислоты Res. 20: 859-864.

21. ↵

    Доуэлл Р. Д., Джокерст Р.М., Дэй А., Эдди С.Р. и Штейн Л. 2001. Распределенная система аннотаций. БМС Биоинформатика 2: 7.

22. ↵

    Дюпюи, Д., Ли, К.Р., Депланке, Б., Боксем, М., Хао, Т., Ламеш, П., Секерра, Р., Босак, С., Дусетт-Стамм, Л., Хоуп, И.А., и другие. 2004. Первая версия промоутера Caenorhabditis elegans . Геном Res. 14: 2169-2175.

23. ↵

    Файер А., Сюй С., Монтгомери М.К., Костас С.А., Драйвер С.Е. и Мелло С.С. 1998. Мощная и специфическая генетическая интерференция двухцепочечной РНК у Caenorhabditis elegans. Природа 391: 806-811.

24. ↵

    Fitch, D. H. 2005. Эволюция: Экологический контекст C. elegans. Курс. биол. 15: Р655-Р658.

25. ↵

    Фокс, Р.М., Фон Стетина, С.Е., Барлоу, С.Дж., Шаффер, К., Ольшевский, К.Л., Мур, Дж.Х., Дюпюи, Д., Видаль, М., и Миллер III, Д.М. 2005. Отпечаток экспрессии генов эмбриональных двигательных нейронов C. elegans . BMC Genomics 6: 42.

26. ↵

    Фрейзер А.Г., Камат Р.С., Ципперлен П., Мартинес-Кампос М., Сорманн М. и Арингер Дж. 2000. Функциональный геномный анализ хромосомы I C. elegans с помощью систематической РНК-интерференции. Природа 408: 325-330.

27. ↵

    Fukushige, T., Schroeder, D.F., Allen, F.L., Goszczynski, B., and McGhee, J.D. 1996. Модуляция экспрессии генов в эмбриональном пищеварительном тракте C.Элеганс. Дев. биол. 178: 276-288.

28. ↵

    Годе, Дж., Муттуму, С., Хорнер, М., и Манго, С.Е. 2004. Полногеномный анализ экспрессии временных генов во время развития передней кишки. PLoS биол. 2: е352.

29. ↵

    Гриффитс-Джонс, С.2004. Реестр микроРНК. Нуклеиновые Кислоты Res. 32: Д109-Д111.

30. ↵

    GuhaThakurta, D., Schriefer, L.A., Waterston, R.H., and Stormo, G.D. 2004. Новые регуляторные элементы транскрипции в Caenorhabditis elegans мышечных генов. Геном Res. 14: 2457-2468.

31. ↵

    Холт, С.Дж. и Риддл, Д.Л. 2003. SAGE исследует углеводный обмен C. elegans : свидетельство анаэробного сдвига у долгоживущей личинки дауэра. мех. Старение Дев. 124: 779-800.

32. ↵

    Хван, Б. Дж., Мюллер, Х.М., и Штернберг, П.В. 2004. Аннотация генома с помощью высокопроизводительного определения 5′-конца РНК.проц. Натл. акад. науч. 101: 1650-1655.

33. ↵

    Международный консорциум по секвенированию генома человека. 2004. Завершение эухроматической последовательности генома человека. Природа 431: 931-945.

34. ↵

    Джонс, С.Дж., Риддл Д.Л., Пузырев А.Т., Велькулеску В.Е., Хиллер Л., Эдди С.Р., Стриклин С.Л., Бейли Д.Л., Уотерстон, Р. и Марра, М.А. 2001. Изменения в экспрессии генов, связанные с остановкой развития и долголетием у Caenorhabditis elegans. Геном Res. 11: 1346-1352.

35. ↵

    Камат, Р.С. и Арингер, Дж. 2003. Полногеномный скрининг РНКи у Caenorhabditis elegans. Методы 30: 313-321.

36. ↵

    Ким, С.К., Лунд, Дж., Кирали, М., Дюк, К., Цзян, М., Стюарт, Дж.М., Эйзингер, А., Уайли, Б.Н., и Дэвидсон, Г.С. 2001. Карта экспрессии генов для Caenorhabditis elegans. Наука 293: 2087-2092.

37. ↵

    Kimble, J. and Hirsh, D. 1979. Постэмбриональные клеточные линии гермафродитных и мужских половых желез Caenorhabditis elegans. Дев. биол. 70: 396-417.

38. ↵

    Кионтке К., Gavin, N.P., Raynes, Y., Roehrig, C., Piano, F., and Fitch, D.H. 2004. Филогения Caenorhabditis предсказывает конвергенцию гермафродитизма и обширную потерю интронов. проц. Натл. акад. науч. 101: 9003-9008.

39. ↵

    Кох, Р., ван Луенен, Х.Г., ван дер Хорст, М., Тийссен, К.Л., и Пластерк, Р.H. 2000. Полиморфизм одиночных нуклеотидов у диких изолятов Caenorhabditis elegans. Геном Res. 10: 1690-1696.

40. ↵

    Kohara, Y. 1996. [Крупномасштабный анализ кДНК C. elegans ]. Танпакушицу Какусан Косо 41: 715-720.

41. ↵

    Корф И., Flicek, P., Duan, D., and Brent, M.R. 2001. Интеграция геномной гомологии в прогнозирование структуры генов. Биоинформатика 17 Приложение 1: S140-S148.

42. ↵

    Kunitomo, H., Uesugi, H., Kohara, Y., и Iino, Y. 2005. Идентификация генов, экспрессируемых реснитчатыми сенсорными нейронами, у Caenorhabditis elegans с использованием направленного вытягивания поли(А)-хвостов.Геном биол. 6: Р17.

43. ↵

    Ламеш П. , Мильштейн С., Хао Т., Розенберг Дж., Ли Н., Секерра Р., Босак С., Дусетт-Стамм Л., Ванденхаут Дж., Хилл , Д.Е. и др. 2004. C. elegans ORFeome, версия 3.1: Расширение охвата ресурсов ORFeome за счет улучшенного предсказания генов.Геном Res. 14: 2064-2069.

44. ↵

    Lee, R.C., Feinbaum, R.L., and Ambros, V. 1993. Гетерохронный ген lin-4 C. elegans кодирует малые РНК с антисмысловой комплементарностью по отношению к lin-14. Ячейка 75: 843-854.

45. ↵

    Ли, С., Армстронг, С.М., Бертен, Н., Ге, Х., Мильштейн, С., Боксем, М., Видалайн, П.О. , Хан, Дж.Д., Шено, А., Хао, Т., и др. др. 2004. Карта интерактомной сети многоклеточных животных C. elegans. Наука 303: 540-543.

46. ↵

    Лим Л.П., Лау Н.К., Вайнштейн Э.Г., Абдельхаким А., Йекта С., Роудс М.В., Бердж С.Б. и Бартел Д.П. 2003. МикроРНК Caenorhabditis elegans. Гены и Дев. 17: 991-1008.

47. ↵

    Лю Ю., Лю Н. и Чжао Х. 2005a. Вывод белок-белковых взаимодействий на основе высокопроизводительных данных о взаимодействии различных организмов. Биоинформатика 21: 3279-3285.

48. ↵

    Лю, З. Дж., Темпель, В., Нг, Дж.Д., Лин, Д., Шах, А.К., Чен, Л., Хораньи, П.С., Хабель, Дж.Е., Катаева, И.А., Сюй, Х., и др. 2005б. Конвейер высокопроизводительного белка в структуру в SECSG. Акта Кристаллогр. Д биол. Кристаллогр. 61: 679-684.

49. ↵

    Лу, С., Симерский Дж., Ли С., Карсон М., Чен Л., Михан Э. и Луо М. 2004. Структурная геномика Caenorhabditis elegans : кристаллическая структура С-концевого домена тропомодулина. . Белки 56: 384-386.

50. ↵

    Luersen, K., Eschbach, M.L., Liebau, E., и Walter, R.D. 2004. Функциональные GATA- и инициатороподобные элементы демонстрируют сходное расположение в промоторах ферментов синтеза полиаминов Caenorhabditis elegans . биол. хим. 385: 711-721.

51. ↵

    Маэда И., Кохара Ю., Ямамото М. и Сугимото А. 2001. Крупномасштабный анализ функции генов у Caenorhabditis elegans с помощью высокопроизводительной РНКи. Курс. биол. 11: 171-176.

52. ↵

    МакКаллум, К.M., Comai, L., Greene, E.A., and Henikoff, S. 2000. Целевой скрининг индуцированных мутаций. Нац. Биотехнолог. 18: 455-457.

53. ↵

    МакКомби, В.Р. , Адамс, М.Д., Келли, Дж.М., Фитцджеральд, М.Г., Аттербек, Т.Р., Хан, М., Дубник, М., Керлаваж, А.Р., Вентер, Дж.C., and Fields, C. 1992. Caenorhabditis elegans экспрессированных тегов последовательностей идентифицируют семейства генов и потенциальные гомологи генов заболеваний. Нац. Жене. 1: 124-131.

54. ↵

    Маккей, С.Дж., Джонсен, Р., Хаттра, Дж., Асано, Дж., Бэйли, Д.Л., Чан, С., Дубе, Н., Фанг, Л., Гощински, Б., Ха, Э., эт др. 2003. Профилирование экспрессии генов клеток, тканей и стадий развития нематоды C. elegans. Харб Колд Спринг. Симп. Квант. биол. 68: 159-169.

55. ↵

    Миллер, М. А., Каттер, А.Д., Ямамото, И., Уорд, С., и Гринштейн, Д. 2004. Кластерная организация репродуктивных генов у C.elegans геном. Курс. биол. 14: 1284-1290.

56. ↵

    Митрева, М., Блакстер, М.Л., Бёрд, Д.М., и Маккартер, Дж.П. 2005. Сравнительная геномика нематод. Тенденции Жене. 21: 573-581.

57. ↵

    Наяк, С., Гори, Дж., и Шедл, Т. 2005. туман-2 и эволюция самофертильного гермафродитизма у Caenorhabditis. PLoS биол. 3: е6.

58. ↵

    Нельсон, Д. В. и Хонда, Б.М. 1985. Гены, кодирующие рибосомную РНК 5S нематоды Caenorhabditis elegans. Бытие 38: 245-251.

59. ↵

    Николаидис Н.и Nei, M. 2004. Согласованная и несогласованная эволюция надсемейства генов Hsp70 у двух родственных видов нематод. Мол. биол. Эвол. 21: 498-505.

60. ↵

    Оккема П.Г. and Fire, A. 1994. Гомеопротеин CEH-22 класса Caenorhabditis elegans NK-2 участвует в комбинаторной активации экспрессии генов в мышцах глотки.Развитие 120: 2175-2186.

61. ↵

    Okkema, PG, Ha, E. , Haun, C., Chen, W., and Fire, A. 1997. Ген гомеобокса Caenorhabditis elegans NK-2 ceh-22 активирует экспрессию гена глоточной мышцы в сочетании с pha -1 и требуется для нормального развитие глотки.Развитие 124: 3965-3973.

62. ↵

    Пиано Ф., Шеттер А.Дж., Мангоне М., Штейн Л. и Кемфуес К.Дж. 2000. РНКи-анализ генов, экспрессируемых в яичнике Caenorhabditis elegans. Курс. биол. 10: 1619-1622.

63. ↵

    Рейнхарт, Б.J., Slack, F.J., Basson, M., Pasquinelli, A.E., Bettinger, J.C., Rougvie, A.E., Horvitz, H.R., and Ruvkun, G. 2000. РНК let-7 из 21 нуклеотида регулирует сроки развития у Caenorhabditis elegans. Природа 403: 901-906.

64. ↵

    Ривас Э. и Эдди С.Р. 2001.Обнаружение гена некодирующей РНК с использованием сравнительного анализа последовательностей. БМС Биоинформатика 2: 8.

65. ↵

    Roulet, E., Busso, S., Camargo, A.A., Simpson, A.J., Mermod, N., and Bucher, P. 2002. Высокопроизводительный метод SELEX SAGE для количественного моделирования сайтов связывания факторов транскрипции. Нац. Биотехнолог.20: 831-835.

66. ↵

    Рой, П. Дж., Стюарт, Дж.М., Лунд, Дж., и Ким, С.К. 2002. Хромосомная кластеризация экспрессируемых мышцами генов у Caenorhabditis elegans. Природа 418: 975-979.

67. ↵

    Санчес, К., Lachaize, C., Janody, F., Bellon, B., Roder, L., Euzenat, J., Rechenmann, F., and Jacq, B. 1999. Цепляние за молекулярные взаимодействия и генетические сети в Drosophila melanogaster используя FlyNets, интернет-базу данных. Нуклеиновые Кислоты Res. 27: 89-94.

68. ↵

    Шаран Р., Сутрам С., Kelley, R.M., Kuhn, T., McCuine, S., Uetz, P., Sittler, T., Karp, R.M., and Ideker, T. 2005. Законсервированные модели взаимодействия белков у многих видов. проц. Натл. акад. науч. 102: 1974-1979 гг.

69. ↵

    Сонничсен, Б., Коски, Л.Б., Уолш, А., Маршалл, П., Нойманн, Б., Брем, М., Аллом, А.М., Артельт Дж., Бетанкур П., Кассин Э. и др. 2005. Полногеномное профилирование РНКи раннего эмбриогенеза у Caenorhabditis elegans. Природа 434: 462-469.

70. ↵
71. ↵

    Штейн, Л.Д., Бао З., Блазиар Д., Блюменталь Т., Брент М.Р., Чен Н., Чинвалла А., Кларк Л., Кли К., Коглан А., и другие. 2003. Последовательность генома Caenorhabditis briggsae : платформа для сравнительной геномики. PLoS биол. 1: Е45.

72. ↵
73. ↵

    Сулстон, Дж.Э. и Бреннер С. 1974. ДНК Caenorhabditis elegans. Генетика 77: 95-104.

74. ↵

    Салстон Дж. и Ферри Г. 2002. Общая нить: история науки, политики, этики и генома человека. Бантам Пресс, Лондон.

75. ↵

    Сулстон, Дж. E. and Horvitz, HR 1977. Постэмбриональные клеточные линии нематоды Caenorhabditis elegans. Дев. биол. 56: 110-156.

76. ↵

    Салстон, Дж. Э., Ширенберг, Э., Уайт, Дж. Г., и Томсон, Дж. Н. 1983. Линия эмбриональных клеток нематоды Caenorhabditis elegans. Дев. биол. 100: 64-119.

77. ↵

    Сулстон, Дж., Маллетт Ф., Стаден Р., Дурбин Р., Хорснелл Т. и Коулсон А. 1988. Программное обеспечение для картирования генома методами снятия отпечатков пальцев. вычисл. заявл. Бионауч. 4: 125-132.

78. ↵

    Свон, К. А., Кертис, Д.Е., МакКьюсик, К.Б., Воинов, А.В., Мапа, Ф.А., и Кансилла, М.Р. 2002. Высокопроизводительное картирование генов у Caenorhabditis elegans.Геном Res. 12: 11:00-11:05.

79. ↵

    Симерский Дж., Лин Г., Ли С., Цю С., Карсон М., Шорманн Н. и Луо М. 2003. Структурная геномика Caenorhabditis elegans : Кристаллическая структура кальмодулин. Белки 53: 947-949.

80. ↵

    Тенг Ю., Жирар, Л., Феррейра, Х.Б., Штернберг, П.В., и Эммонс, С.В. 2004. Выделение цис--регуляторных элементов в промоторе C. elegans Hox гена egl-5. Дев. биол. 276: 476-492.

81. ↵

    Томас, Дж. Х., Келли, Дж. Л., Робертсон, Х. М., Ли, К., и Суонсон, В. Дж. 2005. Адаптивная эволюция в семействах хеморецепторов SRZ Caenorhabditis elegans и Caenorhabditis briggsae.проц. Натл. акад. науч. 102: 4476-4481.

82. ↵

    Тиммонс, Л. и Файр, А. 1998. Специфическая интерференция за счет проглоченной дцРНК. Природа 395: 854.

83. ↵

    Велкулеску, В.Э., Чжан Л., Фогельштейн Б. и Кинзлер К.В. 1995. Серийный анализ экспрессии генов. Наука 270: 484-487.

84. ↵

    Venable, J. D., Dong, M.Q., Wohlschlegel, J., Dillin, A., and Yates, J.R. 2004. Автоматизированный подход к количественному анализу сложных пептидных смесей по тандемным масс-спектрам.Нац. Методы 1: 39-45.

85. ↵

    Vidalain, P.O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., and Vidal, M. 2004. Повышение специфичности в высокопроизводительных двухгибридных экспериментах с дрожжами. Методы 32: 363-370.

86. ↵

    Ван, Д., Kennedy, S., Conte Jr., D., Kim, JK, Gabel, HW, Kamath, RS, Mello, CC, and Ruvkun, G. 2005. Соматическая неправильная экспрессия гранул P зародышевой линии и усиленная интерференция РНК у мутантов пути ретинобластомы . Природа 436: 593-597.

87. ↵

    Washietl, S., Hofacker, I.L., and Stadler, P.F. 2005.Быстрое и надежное предсказание некодирующих РНК. проц. Натл. акад. науч. 102: 2454-2459.

88. ↵

    Уотерстон Р., Мартин К., Крэкстон М., Хьюн К., Коулсон А., Хиллиер Л., Дурбин Р., Грин П., Шонкин Р., Хэллоран, Н. и др. 1992. Обзор экспрессируемых генов у Caenorhabditis elegans.Нац. Жене. 1: 114-123.

89. ↵

    Вей, К. , Ламеш, П., Арумугам, М., Розенберг, Дж., Ху, П., Видал, М., и Брент, М. Р. 2005. Приближение к C. elegans ORFeome путем клонирования Прогнозы TWINSCAN. Геном Res. 15: 577-582.

90. ↵

    Уайт, Дж.Г., Саутгейт, Э., Томсон, Дж.Н., и Бреннер, Ф.Р.С. 1986. Строение нервной системы нематоды Caenorhabditis elegans. Фил. Транс. Рой. соц. Лондон сер. Б биол. науч. 314: 1-340.

91. ↵

    Wicks, S.R., Yeh, R.T., Gish, W.R., Waterston, R.H., and Plasterk, R.H. 2001. Быстрое картирование генов в Caenorhabditis elegans с использованием карты полиморфизма высокой плотности.Нац. Жене. 28: 160-164.

92. ↵

    Wicky, C., Villeneuve, A.M., Lauper, N., Codourey, L., Tobler, H., and Muller, F. 1996. Теломерные повторы (TTAGGC)n достаточны для функции покрытия хромосом у Caenorhabditis elegans. проц. Натл. акад. науч. 93: 8983-8988.

93. ↵

    Вайтман, Б., Ha, I., и Ruvkun, G. 1993. Посттранскрипционная регуляция гетерохронного гена lin-14 с помощью lin-4 опосредует формирование временного паттерна у C. elegans. Ячейка 75: 855-862.

94. ↵

    Вундерлих З. , Актон Т.Б., Лю Дж., Корнхабер Г., Эверетт Дж., Картер П., Лан Н., Эколс Н., Герштейн М., Рост Б., и другие. 2004. Целевой список белков Северо-восточного консорциума структурной геномики. Белки 56: 181-187.

95. ↵

    Zhang, S., Ma, C., и Chalfie, M. 2004. Комбинаторное маркирование клеток и органелл восстановленными флуоресцентными белками.Ячейка 119: 137-144.

Трехмерная среда обитания C. elegans для обогащения окружающей среды

Abstract

По мере того, как мы узнаем больше о важности взаимодействия генов с окружающей средой и эффектах обогащения окружающей среды, становится очевидным, что минималистичные лабораторные условия могут влиять на паттерны экспрессии генов и поведение модельных организмов. В лаборатории Caenorhabditis elegans обычно культивируют на двумерных однородных чашках с агаром, обильно покрытых культурой аксенических бактерий в качестве источника пищи. Однако в дикой природе эта нематода процветает в гниющих фруктах и ​​стеблях растений, питаясь бактериями и мелкими эукариотами. Этот контраст в сложности среды обитания предполагает, что изучение C . elegans в обогащенных лабораторных условиях может углубить наше понимание его основных черт и поведения.Здесь мы разработали протокол для создания трехмерных обитаемых каркасов для трансгенерационной культуры C . elegans в лаборатории. Используя децеллюляризацию и стерилизацию тканей плода, мы создали аксеническую среду, в которой можно перемещаться повсюду и в которой можно строго контролировать микробную среду. С . elegans содержались на протяжении поколений в этой среде обитания и продемонстрировали явную поведенческую предвзятость в отношении обогащенной среды. В качестве первоначальной оценки поведенческих вариаций мы обнаружили, что популяции дауэров в скаффолдах демонстрируют частое, сложное никтационное поведение, включая групповое возвышающееся и прыгающее поведение.

Образец цитирования: Гиснет А., Майтра М., Прадхан С., Хендрикс М. (2021) Трехмерная среда обитания для C . elegans обогащение окружающей среды. ПЛОС ОДИН 16(1): е0245139. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0245139

Редактор: Шон П.Курран, Университет Южной Калифорнии, США

Получено: 30 сентября 2020 г.; Принято: 22 декабря 2020 г .; Опубликовано: 11 января 2021 г.

Авторское право: © 2021 Guisnet et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи и файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Эта работа была поддержана Национальным советом по научным и инженерным исследованиям (NSERC) (RGPIN/05117-2014), Канадским фондом инноваций (CFI) (32581) и Канадской программой исследовательских кафедр ( 950-231541). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Я ознакомился с политикой журнала, и авторы этой рукописи имеют следующие конкурирующие интересы: MH является членом редакционной коллегии PLOS ONE.Авторы заявили, что других конкурирующих интересов не существует. Это не меняет нашей приверженности политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Модельные организмы выращиваются в лабораторных условиях, которые упрощены по сравнению с их дикой естественной средой. Эти условия помогают в стандартизации, однако по мере того, как мы узнаем больше о важности взаимодействия генов и окружающей среды и эффектах обогащения окружающей среды, становится очевидным, что минималистичные лабораторные условия могут влиять на паттерны экспрессии генов и поведение таким образом, что это ограничивает, а не способствует биологическому пониманию. 1, 2].Например, 80% генов пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae могут быть удалены в оптимальных лабораторных условиях, но 97% их генов необходимы для выживания в условиях стресса окружающей среды [3]. Существует противоречие между желательностью простых, однородных условий, поддерживающих воспроизводимость, и искусственной природой признаков, особенно поведенческих, которые могут возникнуть в бедной среде [4]. Растущее количество данных свидетельствует о том, что рассмотрение более широкого спектра факторов окружающей среды и их влияния на интересующие признаки модельных организмов может обеспечить более глубокое понимание биологии [5]. Обогащение окружающей среды, которое включает в себя добавление элементов в жилище животных, которые обеспечивают сенсорную стимуляцию или способствуют активности, исследованию и взаимодействию, является стратегией изучения того, как эти факторы способствуют интересующим биологическим признакам [6]. Например, модели мышей, рыбок данио и домашних сверчков продемонстрировали повышенную производительность в задачах памяти при выращивании в обогащенных условиях [2, 7, 8].

Caenorhabditis elegans обычно изучается в стандартных лабораторных условиях, и лишь недавно больше внимания стало уделяться его экологии и естественной истории.В естественной среде эта маленькая прозрачная нематода встречается в гниющих фруктах или стеблях растений и питается бактериями и мелкими эукариотами [9]. На их экологическую распространенность влияют несколько биотических факторов, таких как присутствие других видов нематод, влажность и дождь [10]. Большинство особей, обнаруженных в природных популяциях, находятся на дауэровской стадии — альтернативной, задержанной в развитии стадии жизненного цикла животного [11]. Дауэрская стадия характеризуется отчасти более тонким телом и никтацией — поведением, при котором нематоды стоят прямо на хвосте и размахивают телом во всех направлениях [12].Считается, что никтация опосредует распространение между источниками пищи, позволяя нематодам прикрепляться к таким организмам, как слизни и многоножки, когда пищевые ресурсы исчерпаны [13, 14]. В то время как генетические механизмы, регулирующие дауэр, были изучены очень подробно, динамика входа, выхода и мигания дауэра в естественных условиях, как и у многих диких признаков C . elegans еще предстоит полностью понять. Условия окружающей среды в дикой природе кардинально отличаются от лабораторных.В стандартных лабораторных условиях черви живут на двумерной, плоской, однородной агаровой поверхности, равномерно покрытой обильными аксеническими бактериальными культурами в качестве источника пищи, и содержатся в условиях стабильной влажности и температуры. Кроме того, дауэровская стадия не встречается у лабораторных стад, содержащихся на пище, но может быть вызвана голоданием или высокой температурой [15]. В то время как пища в изобилии, лабораторные условия в остальном бедны по сравнению с богатой и неоднородной трехмерной природной средой, где дикие C . Элеганс живые. Расширение диапазона контролируемых сред, в которых C. elegans можно культивировать в лаборатории, и, следовательно, их выраженное поведение, может позволить нам лучше понять механизмы, лежащие в основе этого поведения [1].

Сложность изучения нематод в дикой природе и ограничительные стандартные лабораторные условия означают, что мы, вероятно, не знаем истинного диапазона возможных C . elegans поведения и то, как они могут влиять на основные изученные молекулярные и нейронные пути [16].Тем не менее, большинство C . elegans исследования проводятся без учета того, что сенсорные и навигационные механизмы животного адаптированы к трехмерной среде обитания. Чтобы восполнить этот пробел, были протестированы различные методы создания более сложных местообитаний для C . Элеганс . На двумерных чашках с агаром нематоды подвержены сильной силе поверхностного натяжения, и уменьшение этой силы за счет добавления третьего навигационного измерения может смягчить физические ограничения [17, 18].Например, при плавании в условиях жидкой культуры черви проявляют иные паттерны нервно-мышечной активности, чем при ползании по 2D-поверхности [19]. Точно так же их скорость может быть увеличена до десяти раз с помощью специально разработанных микрожидкостных камер [20]. Однако жидкие и гелевые субстраты могут иметь ограничения при сравнении поведения или паттернов генетической экспрессии в стандартных условиях. В частности, животные в жидкой культуре постоянно плавают, будучи подвешенными в жидкости, и не могут проявлять пищевое поведение [21].В гелевых средах пища распределяется по участкам, и животным приходится рыть туннели, чтобы соединить эти участки. Кроме того, эти методы и другие трехмерные среды обитания, такие как использование почвы, формованного агара, шариков или марли, не позволяют проводить индивидуальный отбор животных в поколениях [12, 22, 23].

Здесь, вдохновленные Модулевским и его коллегами [24], мы разработали протокол для создания трехмерных обитаемых каркасов для многопоколенческой культуры C . elegans в лаборатории.Путем децеллюляризации и стерилизации тканей плода мы создали аксеническую среду, в которой можно перемещаться повсюду и в которой можно строго контролировать микробную среду. Поскольку обработанные ткани фруктов могут иметь некоторое сходство с предпочтительными естественными местами обитания плодовых нематод, мы предсказали, что условия окружающей среды трехмерного каркаса будут восприниматься C как благоприятные. elegans и вызывают изменения в поведении. Действительно, C . elegans содержались на протяжении поколений в этой среде обитания и демонстрировали явную предвзятость в поведении трехмерного каркаса. В качестве первоначальной оценки поведенческих вариаций мы обнаружили, что животные демонстрировали более широкий спектр локомоторных паттернов, а популяции дауэров в трехмерных каркасах демонстрируют сложное поведение при мигании, включая групповое вознесение и прыжки, с высокой частотой, что позволяет предположить, что это привлекательная платформа для изучения мигания. .

Результаты

Оформление протокола

Недавний успех Modulevsky и коллег [24] в использовании децеллюляризованной ткани яблока для культивирования клеток млекопитающих в трех измерениях вдохновил нас на использование этой ткани для культивирования C . elegans с E . coli пищевой источник. Мы сделали срезы яблочной ткани толщиной примерно 3 мм, чтобы животные могли располагаться полностью вертикально. Мы децеллюляризировали срезы ткани в додецилсульфате натрия (SDS), оставив после себя только внеклеточный матрикс, содержащий целлюлозу и другой нерастворимый материал клеточной стенки. Для вымывания раствора SDS была проведена серия промывок водой, этанолом и средой для роста нематод (NGM) (см. Материалы и методы).Бактериальную культуру равномерно высевали через каркас путем инкубации срезов каркаса в жидкой бактериальной культуре. Стандартные чашки с агаром засевают той же бактериальной культурой и инкубируют параллельно со срезами каркаса. После инкубации срезы каркаса помещали на стандартные незасеянные чашки с агаром, завершая трехмерную среду обитания. Оба типа планшетов («каркасные планшеты» и «агаровые планшеты») были закрыты парафильмом для предотвращения высыхания (рис. 1А).

Рис. 1. Занятость среды обитания не зависит от условий выращивания.

(A) Пластина каркаса. (B) Схема эксперимента по заполнению. Животных вводили в стартовую площадку на противоположной стороне пищевых участков. Пластыри 2D и 3D располагались на противоположной стороне и на расстоянии 1 см друг от друга. Животных оставляли бродить по чашке в течение ночи, после чего подсчитывали количество животных в каждом месте. (C) Индекс занятости для животных, выращенных на чашках с каркасом и чашках с агаром, когда (слева) оба участка имели одинаковую концентрацию корма с валентностью 1:1 и (справа) когда 3D-участок был разбавлен в 3 раза по сравнению с 2D-участком 3: 1 валентность участка (n = 20–30 животных в повторности, *** p < 0.0001, планки погрешностей представляют собой стандартное среднее значение ошибки).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0245139.g001

Результатом нашего протокола стала пористая, навигационная, структурно стабильная и пригодная для жизни трехмерная матрица. Нам удалось сохранить более 30 поколений C . elegans в новой контролируемой трехмерной среде обитания. Мы визуализировали рост бактерий в каркасе путем посева E . Штамм coli , экспрессирующий GFP. Это показало, что бактерии росли по неравномерному сетчатому образцу, который, по-видимому, следовал интерстициальным пространствам между материалом клеточной стенки растений.Регулируя время инкубации и температуру, мы получили одинаковую плотность бактерий на площадь поперечного сечения между двумя типами чашек (см. Материалы и методы).

С . elegans , перемещаясь по плитам лесов, демонстрировали ползание, а не рытье нор или плавание. Однако характер их движения не был характерно синусоидальным, возможно, из-за пониженного поверхностного натяжения и/или неоднородности каркаса (S1 Movie). Животных нельзя было наблюдать, если они находились внутри каркаса более чем на один миллиметр из-за непрозрачности внеклеточного матрикса и сходства его цвета с телом животного.Глубину обзора можно было примерно удвоить, пропустив лески через вакуумную камеру перед введением червей. Несмотря на это, черви, следы червей и яйца редко встречались вне каркаса (на поверхности агара) до 3–4 дней после введения первых животных L4. Несмотря на первоначальные затраты времени, необходимые для производства децеллюляризованных лесов, простота этапов подготовки и хранения подготовленных лесов делают регулярное использование этого протокола элементарным.Животных можно либо ощипать проволокой, либо скальпелем отрезать кусок лески. Буферы также можно пипетировать над каркасом для сбора животных и яиц.

Использование лесов не зависит от предыдущего опыта

Чтобы исследовать потенциальные отклонения среды обитания, мы провели простой эксперимент с размещением (рис. 1B). Животные стартовали далеко от целевых пищевых пятен, чтобы способствовать хемотаксису в этом общем направлении. Мы расположили один участок с кормом на агаре и один участок с кормом на каркасе относительно близко друг к другу, чтобы два участка были включены в их локальную область поиска [25].При таком расположении животные могут ощущать и исследовать оба участка с едой, прежде чем оседать. Мы использовали небольшое количество особей на реплику, чтобы ограничить любые последствия истощения ресурсов. Таким образом, мы измерили относительную занятость на пищевом пластыре с каркасом, на обычном агаровом пищевом пластыре или ни на одном из них (вне пластыря).

Мы предположили, что условия выращивания будут смещать занятость в сторону знакомого пищевого опыта [26, 27], но свойства матрикса заставят часть выращенных на агаре животных вместо этого поселиться на трехмерном пластыре.Таким образом, мы ожидали, что животные, выращенные на каркасе, будут демонстрировать сильную занятость на участке каркаса и небольшую занятость на участке с агаром, а животные, выращенные на агаре, будут разделяться между двумя участками. Однако, независимо от условий их выращивания, животные, выращенные как на каркасе, так и на агаре, значительно больше занимали участок с кормом на каркасе (рис. 1C и S1). Это показывает, что животных больше привлекают или удерживают в обогащенной среде обитания факторы, на которые не влияет предыдущий опыт.

Чтобы дополнительно изучить воспринимаемые качества трехмерной среды обитания, мы повторили эксперимент по размещению с бактериальным пластырем, разведенным в 3 раза по сравнению с агаровым пластырем (валентность пластыря 3:1). Мы предположили, что снижение качества эшафотного участка за счет уменьшения содержания в нем питательных веществ приведет к уменьшению наблюдаемого ранее смещения для эшафотного участка [26], но эти условия выращивания будут смещать занятость в сторону знакомой среды. Удивительно, но в этих условиях одинаковая доля особей поселилась на скаффолде и на агаровом пятне (рис. 1С и S1).Опять же, на эти результаты не повлияли условия выращивания.

3D-среда обитания способствует сложному никтационному поведению

С . elegans dauers не могут мигать на плоской поверхности агара, что создает трудности для изучения мигания [28]. Однако они будут проявлять мигание, если агар заражен грибком, взбирающимся на гифы гриба [12]. Они также могут демонстрировать групповое мигание (возвышение или «башня дауэра»), карабкаясь друг на друга, если чашка с агаром очень переполнена [29].

Мы исследовали потенциал нашей трехмерной среды обитания для изучения никации, просто выдерживая обитаемые пластины при температуре 20°C в течение нескольких дней. Мы ожидали, что дауэры в трехмерной среде обитания смогут мигать из-за неоднородности поверхности, как описано ранее [12]. Действительно, наибольшее количество актов никтации мы наблюдали у 21-дневных животных. На самом деле, несмотря на различное количество, мы почти всегда наблюдали мигание на чашках каркаса, но никогда не наблюдали мигание на чашках с агаром (рис. 2А).Эти результаты прямо подтверждают предыдущие выводы о том, что отсутствие никтации на агаре вызвано физическими ограничениями, налагаемыми гладкой двумерной подложкой [12, 14, 22, 28].

Рис. 2. Никтационное поведение выражено только в трехмерной среде обитания.

(A) Количество никтирующих 21-дневных животных на стадии дауэра в зависимости от условий выращивания (выращенные на агаре n = 12, выращенные на каркасе n = 14, ** = p<0,01, планки погрешностей являются средним значением стандартной ошибки). (B) Индивидуальная (пустые стрелки) и групповая фиксация (два животных, сплошные стрелки) в трехмерной среде обитания.(C) Мигающий дауэр, прыгающий на кирку экспериментатора.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0245139.g002

Как и в предыдущих отчетах, мы заметили, что мигающие люди либо махали своим телом во всех направлениях, либо стояли прямо и неподвижно (рис. 2B, фильмы S2 и S3). [12]. В обеих ситуациях у индивидуально мигающих животных хвост был закреплен внутри каркаса. Мы были удивлены, увидев прыгающее («дергающееся») поведение при мигании C . elegans при приближении экспериментатора, поскольку ранее сообщалось, что этот вид нематод не имеет такого поведения (рис. 2C и фильм S4) [28]. Животные иногда прилипали и к кирке, и к эшафоту одновременно. Мы также наблюдали формирование и обрушение башни, в том числе от 2 до 30 человек. Как и у индивидуально мигающих животных, башни дауэров либо неподвижны, либо колеблются и формируются, в частности, на более острых участках каркаса, как ранее сообщалось в дикой природе [9].Люди, образующие башни, постоянно двигались и переплетались друг с другом в форме косы. Эти наблюдения показывают, что наша среда обитания позволяет проявлять поведение, подавляемое в стандартных лабораторных условиях.

Обсуждение

Условия, при которых модельные организмы выращиваются в лаборатории, могут сильно отличаться от их естественной среды обитания, и, несмотря на преимущества простых и воспроизводимых условий, воздействие такой обедненной среды может препятствовать научным открытиям [4, 30].Здесь мы представляем новый эффективный и недорогой метод культуры C . elegans в структурно обогащенной трехмерной среде обитания в контролируемых лабораторных условиях. Мы показали, что животные имеют поведенческие предубеждения и выражают сложное мигательное поведение как дауэры в этой среде обитания, включая возвышающиеся и прыгающие. Нам еще предстоит сравнить другие фенотипические и поведенческие признаки, но явных различий пока не наблюдается. Таким образом, мы предполагаем, что сложность этого живого субстрата оказывает значительное влияние на C . elegans поведение, и что необходимо дополнительно охарактеризовать основу этих поведенческих изменений и лежащие в их основе механизмы.

Несколько факторов влияют на то, как C . elegans выбирают источник пищи, включая текстуру, содержание питательных веществ и изобилие [31, 32]. У них также есть экологические предпочтения, основанные на температуре и содержании кислорода [29, 33, 34]. Мы показали, что даже когда были предоставлены два кормовых участка с одинаковым содержанием питательных веществ, животные в подавляющем большинстве занимали трехмерный участок, а не обычный участок, что свидетельствует о важности воспринимаемого качества обогащенной среды обитания и предполагает предпочтение (рис. 1C).Тем не менее, заполняемость была одинаковой между 3D- и 2D-участком, когда качество пищи на 3D-участке снизилось в три раза (рис. 1C). Это говорит о том, что предполагаемые преимущества 3D-пластыря, такие как снижение поверхностного натяжения, увеличение пространства для навигации и сложность роста бактерий, не полностью перевешивают важность доступности пищи. Эти результаты не были связаны с предыдущим опытом работы с трехмерной или двумерной средой обитания. Дальнейшее исследование элементов, которым отдается предпочтение в обогащенной среде, имеет значение для характеристики C . elegans сенсорные способности и различение сенсорного влечения и увеличенного судоходного пространства. В сочетании с отслеживанием поведения наш метод может способствовать пониманию того, как C . elegans выбирают места обитания и то, как ранний жизненный опыт влияет на модели исследования.

Никтация является важным компонентом форетического поведения многих диких нематод [15]. Мы подтверждаем прошлые наблюдения о том, что стандартные лабораторные условия не позволяют проявить такое поведение (рис. 2А) [12, 28].С другой стороны, популяции дауэров на нашем трехмерном каркасе демонстрировали постоянное и сложное поведение при мигании (рис. 2). Преимущество нашей среды обитания для изучения никтационного поведения заключается в том, что животных не нужно перемещать в новую экспериментальную систему, как только они переходят на стадию дауэра. В результате поведение дауэра и мигания можно изучать параллельно на уровне популяции и на протяжении всего развития. Мы полагаем, что проявление никтационного поведения в лаборатории отчасти возможно благодаря уменьшению поверхностного натяжения и сложной топографии неоднородных поверхностей, таких как наша пористая среда обитания [17, 35].В частности, новое наблюдение прыгающего поведения предполагает, что именно это поведение в C . elegans должны быть особенно чувствительны к условиям окружающей среды. Никтация является критически важным поведением для расселения и выживания, и мы считаем, что эта обогащенная среда обитания может позволить ее изучение в C . elegans и родственные нематоды.

Несмотря на сложность визуализации животных внутри лесов, мы демонстрируем, что наша среда обитания пригодна для обслуживания C . elegans поголовье является предпочтительным или способствует сохранению животных по сравнению со стандартными условиями и предлагает новый инструмент для изучения поведения никтации в C . Элеганс . Разрабатывая простой и удобный способ создания обогащенных трехмерных сред обитания, мы даем возможность расширить исследования и рассмотреть результаты в естественных живых измерениях C . elegans и другие нематоды.

Материалы и методы

Штаммы и культуры

Дикий тип N2 C . elegans выращивали в стандартных условиях при 20°C и анализировали на стадии ранней взрослой особи [36]. Червей кормили E . coli OP50-GFP. По всем представленным данным подопытные животные выращивались более 25 поколений в соответствующих средах обитания (среда обитания на лесах или обычная среда обитания с агаром).

Подготовка лесов

Свежеприобретенные яблоки Macintosh ( Malus domestica ) были нарезаны мандолиной на ломтики толщиной 3,175 мм.Яблоки Макинтош были выбраны за их медленное окисление, умеренную пористость для жидкостного обмена и влаги, среднюю жесткость, редкое загрязнение, годовую доступность и общую урожайность. Яблоки перед употреблением выдерживали не более 4 суток при температуре 4°С. Используя форму, ломтики вырезали до однородной круглой формы диаметром 40 мм из ткани гипантия, при этом удаляя кожицу и ломтики, содержащие сердцевину яблочной завязи. Свежевырезанные срезы децеллюляризировали, замачивая в течение ночи (12–24 ч) на встряхивающей платформе в 0.5% SDS с последующей серией промывок в соотношении 10 срезов на литр жидкости проводили для удаления SDS и обезвоживания полученного целлюлозного каркаса в этаноле. Следующие этапы были выполнены в стерильных условиях: три кратких промывания в деионизированной воде, два 30-минутных промывания в деионизированной воде на орбитальном шейкере, одно промывание в 70% этаноле в течение одного часа и, наконец, одно промывание в 100% этаноле в течение одного часа. .

Сразу после последней промывки каждый срез отдельно запаивали в стерильные пакеты для образцов, не удаляя этанол, и хранили при температуре 4°C для хранения.Их хранили не более 3 недель перед использованием, и за этот период времени визуально не наблюдалось деградации.

Тарелка посевная

Мы оптимизировали следующие шаги, чтобы получить одинаковую плотность поперечного сечения бактерий как на чашках с обычным агаром, так и на чашках с целлюлозным каркасом. Для оценки поперечной плотности выращенных бактерий мы извлекали вертикальный образец из каждого типа планшета с помощью стеклянной пипетки. Мы наносили штрихами полученные серийные разведения на чашки с агаром LB и инкубировали их в течение ночи при 37°C, после чего сравнивали КОЕ по площади. Мы сравнили несколько условий роста бактерий, изменив время инкубации, температуру и среду для культивирования бактерий LB/NGM. Планшеты-каркасы систематически демонстрировали более низкую плотность поперечного сечения бактерий и частое высыхание во время инкубационных периодов. Таким образом, мы использовали культуры NGM (в которых бактерии растут менее плотно) для уменьшения плотности поперечного сечения в чашках с обычным агаром и погружали целлюлозные каркасы в бактериальную культуру, чтобы стимулировать рост на всем протяжении, предотвращая высыхание.

Для удаления этанола каждый срез замачивали в жидкости NGM в течение ночи на платформе для встряхивания в соотношении 1 срез на 50 мл жидкости.Срезы каркаса по отдельности помещали в пустую стерильную чашку Петри диаметром 6 см, погруженную в культуру NGM OP50-GFP (около 5 мл). Одновременно в чашки с обычным агаром NGM засевают 100 мкл культуры NGM OP50-GFP. Как погруженные в воду срезы, так и чашки с засеянным агаром помещали в плотно закрытую коробку, которую увлажняли влажными салфетками Kimwipes. Бокс инкубировали при 28°С в течение 5 часов.

После инкубации каждый срез каркаса помещали на чашку с незасеянным агаром NGM и запечатывали лабораторной пленкой.Аналогичным образом, инкубированные чашки с засеянным агаром также закрывали лабораторной пленкой. Оба выдерживались не менее 24 часов в перевернутом виде в плотно закрытой коробке при комнатной температуре лаборатории (20°C) перед использованием. Все планшеты были использованы в течение трех недель (рис. 1А).

Мы установили, что было необходимо герметизировать целлюлозные пластины каркаса перед использованием для поддержания влажности и предотвращения потери качества. Поскольку на метаболизм бактерий влияет газообмен, мы также запечатывали обычные чашки, чтобы иметь одинаковые условия [32].Кроме того, мы заметили, что хранение чашек в перевернутом положении замедляет высыхание и помогает сохранить целостность каркаса, вероятно, из-за пористости целлюлозного каркаса и способности агара впитывать.

Отбеливание

Для отбеливания червей, выращенных на каркасах, каркасы сначала разрезали на три параллельные части. Кусочки накладывали друг на друга и перемещали на край чашки Петри. 2 мл раствора хлорной извести (2 хлорная известь: 1,5 М NaOH) разбрызгивали по разрезанному каркасу, удерживая пластину под противоположным углом, чтобы животные и яйца были вымыты и собраны на противоположной стороне.Этот шаг повторяли несколько раз (избегая повторного введения яиц и червей), чтобы убедиться, что как можно больше червей и яиц покинуло каркас. Затем агар соскребали кончиком пипетки для отделения фиксированных червей и яиц. Наконец, яйца в отбеливающем растворе трижды промывали водой Milli-Q в соответствии со стандартным протоколом отбеливания [37].

Эксперимент занятости

Чтобы оценить погрешности в отношении субстрата среды обитания, мы разработали простой эксперимент по заселению (рис. 1B).Мы посеяли два участка 10 мкл лиофилизированной культуры LabTIE International OP50 на одну сторону большой чашки с агаром NGM: один на кусок целлюлозного каркаса диаметром 1 см и один непосредственно на агаровый спред, чтобы он был того же размера, что и каркас (1:1). патч-валентность). Пятна 2D и 3D находились на расстоянии 1 см друг от друга. Через час после посева от 20 до 30 молодых взрослых червей помещали в исходное положение и оставляли исследовать планшет на ночь при комнатной температуре. Затем мы подсчитали животных за пределами пищевого участка и на обычном участке и вычли все это из исходного количества животных, чтобы определить, сколько животных было на эшафоте.Мы повторили этот эксперимент для животных, выращенных на чашках с обычным агаром, и животных, выращенных в целлюлозном каркасе, в течение нескольких поколений. Чтобы создать пищевой пластырь более низкого качества на каркасе, мы разбавляли высушенную культуру OP50 втрое водой (валентность пластыря 3:1). Индекс занятости рассчитывался для каждой повторности задачи.

Показатель индекса занятости находится в диапазоне от -1 до +1. Более положительный индекс указывает на более высокую занятость 3D-патча, тогда как более отрицательный индекс указывает на более высокую занятость 2D-патча.

Никтация

Чашки с агаром и каркасом хранились при температуре 20°C после использования для содержания червей. Через 21 день на глаз подсчитывали количество мигающих дауеров. Из-за подавляющего числа мигающих особей на опорных пластинах, мигание оценивали в области, состоящей из полос шириной 1 см, проведенных по диаметру каждой пластины. Каждая пластина подсчитывалась независимо двумя экспериментаторами, и использовалось среднее значение. Нематоды, образующие башни дауэров, также учитывались как мигающие особи.Чашки с агаром и каркасом, которые были треснувшими или загрязненными, не включались в подсчет.

Статистический анализ

Все статистические анализы и графики были созданы с помощью статистического программного обеспечения R [38]. t-критерий с равной дисперсией был выполнен между группой, выращенной на агаре, и группой, выращенной на каркасе, для подсчета никтации. Трехфакторный тест ANOVA был выполнен для эксперимента занятости с последующим апостериорным Тьюки-HSD. Значимость оценивалась как p < 0.05.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Смещение для 3D среды обитания теряется при ухудшении качества пищи. .

10.1371/journal.pone.0245139.s001

(PNG)

Благодарности